杭州地区番茄苗期猝倒病的8种腐霉的DNA多态性

从28种随机引物中筛选出25种对腐霉属的10株计8种腐霉进行RAPD分析,发现腐霉属的DNA多态性是非常丰富的和普遍存在的,初步计算了10株计8种腐霉的Nei氏遗传距离,利用类平均法得到UPGMA系统树,并对它们的亲缘关系从DNA分子水平上进行了初步分析.结果表明：在这8种腐霉中,P.kunmingense与P.irregulare亲缘关系最近;P.aphanidermatum与P.tardicrescens的亲缘关系最近;P.ultimum与P.debaryanum的亲缘关系最近;P.debaryanum与P.dissotocum的亲缘关系最近.UPGMA的系统树表明这8种腐霉明显分成三大类,P.kunmingense,P.irregulare与P.spinosum聚成一类;P.aphanidermatum与P.tardicrescens聚成一类;P.ultimum,P.debaryanum与P.dissotocum聚成一类.该结果与形态分类基本相符合.     

栽培大豆品种间遗传关系的RAPD研究

选用８１种随机引物,利用ＲＡＰＤ技术对１３种栽培大豆品种的基因组ＤＮＡ多态性进行了分析,结果表明大多数的随机引物均得到了良好的ＰＣＲ扩增结果,显示出不同的栽培大豆品种之间基因组ＤＮＡ既有高度的同源性,又具有良好的多态性．通过Ｎｅｉ氏遗传共享度分析,使用ＵＰＧＭＡ（ｔｈｅｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｆｏｒａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅｓ）进行聚类分析,得到了ＵＰＧ－ＭＡ系统树和实验材料之间的遗传关系．     

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。     

家蚕的RAPD及其品种间差异

采用ＲＡＰＤ技术对家蚕基因组ＤＮＡ进行多态性研究，分析了各供试品种材料之间的遗传差异。结果表明，ＲＡＰＤ能反映各基因组之间丰富的多态性，聚类分析所得的各供试品种材料之间的亲缘关系和常规遗传分析的结论相一致。因此，认为ＲＡＰＤ可以作为家蚕分类及系统学研究的一种方法．     

基质 炼苗 季节对铁皮石斛试管苗假植的影响

研究了炼苗和不同基质以及季节对铁皮石斛组培苗假植成活率和生长的影响。结果表明:于春季移栽,经过炼苗,选用苔藓:泥炭土:珍珠岩3:1:1为基质,铁皮石斛组培苗假植成活率达95%以上。     

家蚕BmAWD基因的表达和蛋白纯化

家蚕BmAWD与家蚕翅膀发育密切相关,控制其翅膀发育的完整性及可用性。在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到-条编码AWD蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为689bp,ORF框为465bD,编码154个氨基酸残基,含有-个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确,在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在43kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS—PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,目的蛋白通过与层析柱上的GST磁珠结合而被纯化分离。     

家蚕小热休克蛋白基因BmHSP20.8的表达及功能研究

小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。从构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了一条全长764 bp的基因序列(GenBank登录号:AAG30944.1),其开放阅读框(ORF)长561 bp,编码186个氨基酸。用生物信息学方法对此序列进行同源性分析,表明该序列是一条保守性高达85%的家蚕小热休克蛋白20.8(BmHSP20.8),无跨膜结构,主要分布于细胞质。将该序列的ORF与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21进行原核表达,纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清。通过亚细胞定位技术研究BmHSP20.8在正常和热激状态下的家蚕卵巢上皮细胞Bm5和BmN中的变化,结果显示热激后BmH-SP20.8蛋白从细胞质往细胞膜方向迁移。有BmHSP20.8表达的大肠杆菌菌株经48℃处理后,其生存率比未表达BmHSP20.8蛋白的菌株高4倍左右,说明BmHSP20.8蛋白在大肠杆菌中表达能够提高细菌体在高温环境下的生存率。     

利用家蚕蛹生物反应器生产的人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子口服给药的临床前安全性评价

开发了用家蚕蛹表达的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的口服药物。试验评价了猕猴、大鼠和小鼠口服rhGM-CSF毒性情况,包括遗传毒性、单剂量和重复剂量的全身毒性以及生殖毒性。毒理学试验显示:静脉给药在NIH小鼠中最大耐受剂量为3 300μg/kg,LD50为2 020μg/kg,在SD大鼠中LD50为3 660μg/kg。在猕猴和大鼠的重复剂量毒性试验结果中显示:口服rhGM-CSF后,除了雌性SD大鼠的血糖含量外,其余各项指标包括白细胞、红细胞、血红蛋白含量、血小板数量以及血细胞凝集等都正常。雌性大鼠每天口服剂量为1 250μg/kg时,给药后血糖浓度显著增加(P<0.001),但在恢复期间可恢复到正常水平。微核实验、CHL染色体畸变试验和埃姆斯测验法都表明无论是在体内还是体外服用rhGM-CSF均未见遗传毒性,普通的生殖毒性试验和围产期及致畸敏感期的毒性试验均未见异常现象,表明口服rhGM-CSF无明显生殖毒性。临床前毒性试验表明口服超过临床剂量10倍的rhGM-CSF与严重的慢性中毒没有联系,其在药理学有效剂量的范围内是很安全的。     

蚕卵冻干粉的免疫调节和延缓衰老的功能研究

以小鼠和果蝇为实验动物,探讨了蚕卵冻干粉的免疫调节和延缓衰老的功能。结果表明:50、100和300mg/kg剂量的蚕卵冻干粉对小鼠迟发性变态反应均有显著的影响,50mg/kg剂量可使小鼠血清溶血素HC50比对照组提高88%,碳廓吞噬指数提高15%,巨噬细胞吞噬比率提高65%,心肌脂褐质与对照组相比降低22%,肝脏SOD比活力提高16%;300mg/kg可使肝脏SOD活力提高28%;各剂量组均可延长果蝇的平均寿命,以100mg/kg最为显著。认为蚕卵冻干粉具有明显的免疫调节功能和延缓衰老作用。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。