家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

人乳铁蛋白cDNA的克隆及在家蚕细胞中的表达

从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白(hLF)cDNA,其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性(同源性达到99%)。将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点,构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK6DNA共转染家蚕细胞BmN,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过3轮纯化,获得重组病毒BmNPV-hLF。蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中存在人乳铁蛋白基因的表达产物,分子量约78kD,ELISA法测定结果表明家蚕细胞中重组人乳铁蛋白(rhLF)相对表达量在表达120h达到最高值,约为13.5mg/L。体外生物活性试验表明重组hLF对大肠杆菌JM109具有抑菌活性。     

家蚕血球的分离及细胞毒性试验

①根据以metrizamide 作为介质的密度梯度离心法,进行家蚕血球的分离试验时,血浆细胞、颗粒细胞和拟绛色细胞的宽带位于上部,含有颗粒细胞和小球细胞的狭带位于下部。这个结果表明了根据密度差分离家蚕血球的可能性。②使抗家蚕血球兔血清和土拨鼠补体作用于家蚕血球时,随着血清稀释度降低,血球死亡率逐渐上升,以致达到90%以上。可以认为由于抗血球血清和补体的共同作用,能破坏家蚕血球。     

家蚕类p23蛋白基因的表达分析

p23蛋白发现于Hsp90分子伴侣复合体中,在真核生物中广泛存在且高度保守。家蚕中的同源蛋白命名为类p23蛋白。逆转录PCR显示类p23蛋白基因Bm-p23-like在家蚕5龄第6 d幼虫的卵巢、睾丸等8个组织中有表达,但拷贝数有较大差异,可能与组织的活跃程度有关。利用实时定量PCR技术对Bm-p23-like及hsp90在家蚕温度胁迫条件下的表达进行定量分析,结果显示：在高温条件下,该基因与hsp90表达较对照组均有增加,二者比值是42.23（非胁迫对照组是25.10）;在低温条件下,该基因的拷贝数是对照的19.90倍,而hsp90是对照的0.60倍,二者比值仅为0.89。因此,我们推测在温度胁迫条件下家蚕类p23蛋白具有独立于Hsp90的功能。     

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ＡＣＣ合酶氨基酸保守区设计两组简并引物,用套式ＰＣＲ技术从桃成熟果实ｃＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ大小特异性片段,将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,对重组克隆ｐＰＡＣＳＩ进行全序列测定表明,插入片段全长１１００个碱基,编码３６６个氨基酸,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ＡＣＣ合酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为７２．７％,７１．３％,７１．１％,６９．１％,６５．４％。ＲＮＡ点杂交表明ｐＰＡＣＳＩ基因随着桃果实成熟表达活性增强,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。     

用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体

家蚕（Bombyx mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一，若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到重要的意义。研究从天蛹中提取家蚕基因组DNA，用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0.5kb两个片段。DNA序列分析表明，不同蚕品种2－7外显子范围内DNA序列源性达95．7％。用PCR的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列，并克隆到轻链基因的5kb和0.5kb两个片段中间，使GFP基因具有正确的读码框，能和轻链蛋白融合表达。将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG，用于家蚕丝腺生物反应器的研究。     

十大功劳属植物化学成分和生物活性研究进展

本文从化学成分和生物活性两方面综述了十大功劳属（Mahonia Nutt．）植物近十几年来的研究进展,为十大功劳属（Mahonia Nutt．）植物的进一步开发利用提供一定的科学依据。     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

水杉种子中总黄酮含量及其清除自由基能力分析

用紫外分光光度法,以芦丁作对照,测定水杉(Metasequoia glyptostroboides)种子中的总黄酮含量,以BHT和维生素C作对照,比较其对DPPH自由基的清除能力.结果表明,水杉种子中总黄酮含量为34.7 mg/g,其清除DPPH自由基的能力随质量浓度升高而增强,达到EC=145.6 μg/mL,低浓度时低于BHT,随着浓度增高,高于相同质量浓度的BHT,低于维生素C,但在400 μg/mL时,与维生素C持平.水杉种子中黄酮有较高利用价值,作为天然抗氧化剂有良好的应用价值.