抗纹枯病、赤霉病的转TaPIEP1基因小麦的分子鉴定与选育

小麦纹枯病(主要病原为禾谷丝核菌)和赤霉病(主要病原为禾谷镰刀菌)已成为我国小麦生产的重要病害。TaPIEP1是从小麦中分离到的1个病原诱导的基因,其编码蛋白是可与GCC-box顺式元件结合、转录激活型的ERF转录因子。本研究以8个转TaPIEP1基因小麦株系的T₄和T₅代植株为试材,进行了外源转TaPIEP1基因的PCR检测、Southern杂交、RT-PCR与Q-RT-PCR的分析以及纹枯病菌、赤霉病菌接种与抗性鉴定。结果表明,外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝或双拷贝整合到7个转基因小麦株系基因组的不同位点;外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能超量表达;与受体扬麦12相比,TaPIEP1表达水平高的8个转基因小麦株系对纹枯病抗性显著提高,4个株系中一些材料对赤霉病抗性显著提高,3个株系中一些材料兼抗纹枯病和赤霉病,说明TaPIEP1正向参与了小麦对纹枯病和赤霉病抗性反应,利用该基因通过基因工程可创制抗纹枯病、赤霉病的小麦新种质。     

兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质的创制与鉴定

TaLTP5是从小麦中分离到的一个脂质转移蛋白编码基因。利用基因枪介导法将TaLTP5表达载体pA25-TaLTP5转入抗白粉病的小麦品种扬麦18 (含抗白粉病基因Pm21)中, 旨在选育兼抗全蚀病和白粉病的小麦新种质。对转基因小麦T₀~T₃代植株中引入TaLTP5基因进行分子检测和抗病性鉴定。PCR检测、Southern杂交分析结果表明, 外源TaLTP5基因已转入、整合到3个转基因小麦株系的基因组中, 并能稳定遗传; 荧光定量RT-PCR的分析以及全蚀病菌的接种与鉴定结果表明, 与受体小麦扬麦18相比, 这3个转基因小麦株系中TaLTP5表达量显著提高, 其对全蚀病的抗性也明显增强。对3个转基因株系的Pm21分子标记和白粉病抗性鉴定表明, 外源TaLTP5基因的导入没有影响受体小麦对白粉病抗性, 说明这些转基因株系为兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质。     

小麦抗病基因类似序列BRG1的分离与功能分析

利用cDNA-AFLP技术筛选到1个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642中特异表达的小麦抗病基因类似序列(BYDV resistance-related gene1, BRG1)的基因片段。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从YW642中分离出BRG1基因全长cDNA序列,获得了一个通读的抗病同源基因cDNA序列,编码由645个氨基酸组成的蛋白质,包含1个NB-ARC保守结构域和3个LRR结构域,该蛋白属于nucleotide-site binding, leucine-rich repeats (NBS-LRR)家族。荧光定量或半定量RT-PCR表达分析表明,BRG1在抗病小麦易位系YW642叶片中优势表达,受BYDV的诱导,BYDV接种后48 h表达量最高,BRG1在感病小麦亲本中8601中表达量始终较低,随BYDV接种时间延长呈轻微的下调趋势;而且外源激素水杨酸(SA)与茉莉酸(JA)处理可上调该基因在YW642中的表达。利用病毒介导的基因沉默技术分析了BRG1基因的功能,结果表明该基因沉默的抗病小麦易位系YW642中BYDV相对含量增加,但未造成抗病性表型显著改变,说明该基因参与抗黄矮病反应,但不是小麦抗黄矮病重要基因。     

源于L1的小麦抗黄矮病基因的特异PCR标记及辅助育种的研究

以小麦-中间偃麦草附加系L1为抗源, 选育出抗黄矮病小麦异源易位系HW642, YW443, YW243, Y991029等. 本文以上述易位系及其抗源、小麦亲本作供试材料, 鉴定出一个微卫星(Simple sequence repeat, SSR)标记gwm37-450, 可跟踪、检测源于L1的抗黄矮病基因. 将难以分辨、稳定性差的gwm37-450特异带分离、克隆、测序, 根据测序结果     

过表达TaPK-R1基因增强了小麦对纹枯病的抗性和耐冻性

小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和倒春寒是小麦生产中重要的生物和非生物胁迫因子,本研究目的是利用转基因技术改良小麦的纹枯病抗性和耐冷性。利用构建的转基因载体pAHC25-MYC-TaPK-R1,通过基因枪介导法,将小麦AGC蛋白激酶基因TaPK-R1导入春小麦品种扬麦20,获得TaPK-R1过表达的转基因小麦。对T1至T4代植株进行PCR、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot分析,筛选到3个转基因小麦株系,外源TaPK-R1基因能够在其植物体内遗传和超量转录,并翻译成蛋白质。利用致病力不同的R. cerealis菌株R0301和WK207,分别对3个转基因株系T1至T2代和T3至T4代进行纹枯病抗性鉴定,发现TaPK-R1过量表达提高了转基因小麦的纹枯病抗性,3个转基因株系各世代的纹枯病平均病级为1.16~2.11, 病情指数为23.20~42.10,而对照扬麦20的纹枯病病级为2.55~3.60,病情指数为51.00~72.00。用?9℃低温处理三叶一心期小麦幼苗24 h,对照扬麦20的存活率为17%,3个转基因小麦株系的存活率分别为52%、79%和96%。上述结果表明,TaPK-R1过量表达能显著增强小麦对纹枯病的抗性及对冻害的耐受性, 所获得的3个转基因小麦株系可作为潜在的抗源材料。     

利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆

根据已克隆植物抗病（R）基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物,利用同源序列法PCR扩增、克隆到9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段（Resistance Gene Analogs,RGAs）。利用抗黄矮病材料(含Bdv2)、感黄矮病材料（无Bdv2）进行RFLP分析,筛选到1个NBS类RGA序列TirgaZ1与Bdv2连锁。根据TirgaZ1的序列重新设计1对引     

抗根腐病的TaMYB86过表达转基因小麦的创制与分子功能鉴定

小麦根腐病是一种难以防治的小麦土传病害。TaMYB86是一个小麦中受根腐病菌诱导表达的MYB编码基因。本文构建了TaMYB86的过表达转基因载体pUbi:MYC-TaMYB86,利用基因枪介导法将其转入推广小麦品种扬麦16。对转TaMYB86基因小麦T0-T3代植株进行分子特征分析和抗病鉴定。PCR检测结果表明,外源TaMYB86已转入3个转基因小麦株系中; qRT-PCR结果显示,TaMYB86在3个转基因小麦株系中的表达量显著高于在未转基因扬麦16中,约为未转基因扬麦16中的5~6倍,表明TaMYB86可在转基因小麦中过量转录; Western杂交结果表明,引入的TaMYB86可在上述3个转基因小麦株系中翻译表达。对转TaMYB86基因小麦与未转基因扬麦16进行根腐病菌接种与抗病鉴定表明,3个转TaMYB86基因小麦株系在T1-T3代的根腐病病情指数分别为31.75、50.00、45.00; 37.75、37.50、38.50; 41.75、31.25、37.50; 在3次鉴定中未转基因扬麦16的根腐病病情指数分别为75.04、54.17、65.38,转TaMYB86基因小麦T1~T3代的根腐病抗性均显著高于未转基因扬麦16 (P < 0.01)。与未转基因扬麦16相比,转TaMYB86基因小麦中3个下游防卫基因(PR10、PR17c和Chit1)的转录水平也显著上调。以上结果说明,TaMYB86过表达可显著增强转基因小麦的根腐病抗性,在小麦防御根腐病过程中起正向调控作用。     

转TaPK-R1基因小麦的农艺性状评价

为了评估转基因小麦中TaPK-R1基因的组成型表达对农艺性状的影响,采用PK372、PK394、PK465和PK495 4个转基因株系以及受体对照扬麦20分别进行TaPK-R1基因表达分析,以及按常规种植方法进行小区产量试验与考察主要农艺性状。结果表明,TaPK-R1基因的组成型表达除了提高转基因小麦对纹枯病和赤霉病的抗性外,对小麦的生育期、产量性状、株高、主穗性状和籽粒性状等主要农艺性状未产生显著影响。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

小麦3个抗白粉病基因聚合于推广品种后代抗性的遗传分析

为了明确不同抗小麦白粉病基因聚合于推广品种后代的抗性表现,通过复合杂交,将抗小麦白粉病基因Pm4b,Pm13,Pm21聚合并转入推广品种,其后代(F1,F2)进行人工接种和表型抗病调查.结果表明,F1中凡是含有抗白粉病基因之一的材料均表现高抗或免疫.F2中Pm4b,Pm13和Pm21抗病基因聚合的抗病株占的比例最大(71.82%),Pm13和Pm21,Pm4b和Pm21聚合的抗病株占的比例次之(66.67%,64.14%),Pm4b和Pml3抗性基因聚合的抗病株占的比例较小(63.93%).2个抗病基因聚合体中含有Pm21基因的抗性最好.