SARS冠状病毒PUP5蛋白的表达、纯化及鉴定

经RT-PCR扩增了SARS冠状病毒（SARS-CoV）BJ01株的PU5基因（putative uncharacterized gene5）的cDNA，将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，命名为pGEX-PU5，测序正确后将阳性质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，表达的融合蛋白命名为pGEX-PuP5，并用Glutathione Swpharose^TM 413亲和层析柱对表达产物进行纯化，然后用PreScission^TM Protease酶对融合蛋白进行解离，获得PUP5蛋白，用抗SARS-CoV卵黄抗体IgY和GST-tag单克隆抗体分别对表达的目的蛋白做Western blot鉴定，证明所表达的蛋白具有免疫学活性。本研究应用原核表达系统表达了PUP5蛋白，为进一步解析该蛋白功能奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒M2基因的原核表达及纯化

将含缺失跨膜区M2蛋白重组质粒pGEXsM2的大肠杆菌，用终浓度为0．6mmol／L IPTG在37℃下诱导表达，获得可溶性表达的融合蛋白；在Western blot试验中，M2特异性单克隆抗体14C2与目的蛋白发生反应，在35kD处有一条特异性条带，表明表达的重组M2蛋白具有免疫学活性；表达产物使用GST亲和吸附柱进行纯化，获得了大量的目的蛋白及微量的GST蛋白，使用分光光度仪确定纯化后M2蛋白的浓度约为5．6mg／mL。本实验为进一步研究M2生物学特性、建立M2特异性抗体的间接ELISA检测方法及研制M2亚单位疫苗奠定了基础。     

红景天种内遗传多样性分析AFLP方法建立

研究建立一种用于药用植物红景天种内遗传多样性分析的AFLP分子标记方法.以提取红景天(Rhodiola.rosea L)种基因组DNA为模板,25 μL酶切体系中采用两步双酶切(Mse I、EcoR I),在20 μL连接体系中采用T4连接酶,22℃连接过夜,50 μL体系预扩增,Taq Plus酶2.5 U,dNTP 160 μM,对应引物0.5 μM,10×PCR Buffer(含Mg2+) 4.5 μL,25 μL体系选择性扩增,Taq Plus酶1.5 U,dNTP 80 μM,对应引物 0.25 μM,10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5 μL.AFLP分子标记技术是一种快速、准确、稳定的药用植物红景天的种内遗传多样性分析手段.     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly（I）／（C）诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT—PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列。序列分析表明：该基因编码区长2118bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性。通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL—N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近。北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49．5％～76．8％,氨基酸同源性为44．1％～61．6％。据此可以推断：克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关。     

核酸免疫制备抗猪流感病毒HA单克隆抗体

为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。     

表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测

慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。     

非手术疗法治疗幼犬脐疝

幼犬脐疝是临床上常见的病症之一,大多通过手术治疗。笔者经多年临床实践,采用非手术疗法,治疗未发生粘连的各种大小脐疝,效果较好,现将本办法做以介绍,供大家参考。     

黄色短杆菌氟基丙酮酸敏感型突变株的诱变选育

以黄色短杆菌 (Br.FlavumC - 12 )为出发菌株 ,亚硝基胍 (NTG)为诱变剂 ,通过诱变选育 ,筛选出氟基丙酮酸 (FP)敏感的菌株 ,以希望达到降低L -丙氨酸产率的目的