sacB介导的绿针假单胞菌YL-1遗传操作方法

绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis YL-1是从大豆根围分离获得的,对多种病原细菌和病原真菌有较强抑制作用。为了探明绿针假单胞菌YL-1生防相关基因的功能,本研究以嗜铁素转录调控因子PvdS编码基因为对象,建立了一套基于负选择标记基因sacB的绿针假单胞菌无标记基因敲除技术,构建重组质粒pEX18-pvdS,通过改良的细菌接合转移技术将重组质粒导入野生型菌株YL-1中,利用同源重组技术获得缺失突变株ΔpvdS。生防相关性状研究结果表明,与野生型菌株YL-1相比,突变株ΔpvdS泳动能力和生长能力未发生改变,但是群集运动能力显著下降。同时突变株ΔpvdS合成嗜铁素的能力也显著下降,pvdS基因互补后突变株能恢复合成嗜铁素的功能。本文结果表明,已成功建立了适用于YL-1的基因定向敲除技术和功能基因互补体系,为深入研究YL-1的生防机制奠定了重要基础。     

转运蛋白MoMfs2对稻瘟病菌细胞壁完整性和杀菌剂外排的调控

【目的】稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上一种最具破坏性的真菌病害,严重威胁我国的水稻生产安全。研究转运蛋白MoMfs2编码基因MoMFS2(MGG＿01301)在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能,为开发新型杀菌剂提供参考。【方法】利用基因敲除策略将其进行缺失突变并对突变体进行了一系列的生物学表型分析。【结果】实验显示该突变体无论在自然培养基还是在合成培养基上,生长速率较野生型均没有变化,表明MoMFS2基因不参与稻瘟病菌对营养的吸收利用;另外,该突变体原生质体释放速度变慢,对细胞壁胁迫因子刚果红和SDS耐受性显著增强,表明该基因参与了对细胞壁胁迫的应答,进一步推测其在稻瘟病菌细胞壁完整性发挥重要作用。此外,该突变体不能在含有刚果红和ABTS平板上产生晕圈,同时其对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌显著降低,表明MoMfs2参与了对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌;另外该突变体对不同类型的杀菌剂(咪鲜胺、多菌灵、和嘧菌酯)敏感性显著增强,表明该突变体对杀菌剂的耐受性降低,推测MoMFS2基因参与了稻瘟病菌对杀菌剂的外排。通过水稻喷雾和大麦离体致病性测定发现该突...     

江苏省水稻品种对稻曲病的抗病性鉴定及病菌致病力分化

用人工注射接种的方法鉴定了江苏省主要水稻品种对稻曲病的抗病性,研究了稻曲病菌的致病力分化.结果表明:在198个品种中,盐稻1201、南京17113等44个品种对稻曲病表现为完全免疫(CI);淮66、常优008、淮68等34个品种表现为高抗(HR);寸三粒、香优953等29个品种表现为抗病(R);A2、芒小白万等37个品种表现为中抗(MR);香子糯、早插稻等31个品种为中感(MS);天丰优559、盐优1120等15个品种表现为感病(S);黄壳油占、小红粳、CVR4等8个品种表现为高感(HS).用46个单孢菌株分别对粤938、淮9508、武运粳3号3个已知不同抗性品种进行致病力分化的研究,结果表明不同抗病性的品种对同一菌株的反应差异较大,不同菌株对同一品种的致病力有显著差异,致病力分化较明显.     

解淀粉芽孢杆菌Lx-11产脂肽类物质鉴定及表面活性素对水稻细菌性条斑病的防治作用

【目的】对解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的脂肽类物质进行分离鉴定和水稻条斑病防效测定。【方法】根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对Lx-11进行PCR扩增检测,采用MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分析。【结果】通过3对特异性引物对Lx-11菌株检测,扩增产物经克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌Lx-11基因组中含有sfp、fenB、ituA或bamA基因。质谱分析发现提取的粗提物中含有surfactin、bacillomycin D和fengycin等3种脂肽类抗生素。通过构建surfactin突变体菌株,平板和盆栽试验显示突变体菌株抑制条斑病菌能力显著降低。【结论】解淀粉芽孢杆菌Lx-11产生的surfactin类物质对条斑病菌具有较强的抑制作用,是抑制条斑病菌主要物质之一。     

枯草芽孢杆菌Bs916中脂肽抗生素Bacillomycin L的操纵子结构及生物活性

【目的】明确枯草芽孢杆菌Bs916(Bacillus subtilis 916)分泌的脂肽化合物Bacillomycin L操纵子、结构和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治病害的分子生化机制。【方法】采用LA-PCR和基因步行的方法克隆bacillomycin L的操纵子Bac;通过生物信息学的方法分析Bac操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Bac操纵子合成的脂肽类化合物bacillomycin L的分子量;利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片测定bacillomycin L肽端的一级结构;通过平板对峙实验和溶血活性试验测定bacillomycin L的生物活性。【结果】克隆到全长约39.0kb的Bac操纵子,该操纵子由BacD、BacA、BacB和BacC4个多功能复合酶及1个启动子组成;生物信息学分析表明Bac操纵子与脂肽类化合物iturinA、mycosubtilin、bacillomycin D操纵子具有很高的同源性,然而也发现一段低同源性区域,该区域是一个新型Ser激活结构域。根据Bac操纵子特征推测Bac操纵子编码的脂肽类化合物可能是Bacillomycin L;Bac合成的脂肽类化合物的分子量分别为:1008,1022,1036和1050Da;推测属于相差一个(-CH2)亚甲基的同系物;脂肽化合物的一级结构为[cyclo-(Asn-Tyr-Asn-Ser-Glu-Ser-Thr-β-amino fattyacid)],该一级结构与以前报道的bacillomycin L的肽序列一致。生物活性测定结果表明其是一种生物表面活性剂,具有广谱抗真菌活性。【结论】本研究克隆了bacillomycin L的完整操纵子,并通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了枯草芽胞杆菌Bs916分泌的脂肽bacillomycin L的化学结构,并阐明了生防菌Bs-916分泌的脂肽bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子。     

防治水稻病害微生物农药纹曲宁的研制及产业化

江苏省农业科学院植物保护研究所从20世纪90年代初开始与国际水稻研究所合作,开展生物防治水稻病害的研究,并列入国家科技攻关(96-005-01-01-01)等重大科研项目。通过土壤拮抗细菌的系统筛选和理化诱变选育菌种,获得对多种病原菌有很强抑制作用、对水稻病害有良好防效的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B-916)菌株。B-916具有优势种群竟争力和分泌     

解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^TM LC-18柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^-1;70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^-1;100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^-1。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13-C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z= 1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9 Da,是C15-C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13-C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·mL^-1 bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·mL^-1surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·mL^-1,发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。     

生防菌SF-193对空心莲子草防除效果及其影响因子的研究

摘要：在室内控制条件下，测定了SF-193菌株培养液对空心莲子草的致病力；在田间小区试验的条件下，测定了SF-193对空心莲子草的防除效果，以及不同因子对SF-193除草效果的影响程度。结果表明，SF-193培养3～5d的培养液具有最强的致病力；最佳接种体为含有菌丝体的培养液；田间有效接种浓度为10倍稀释液，室内有效接种浓度为25倍稀释液；适宜SF-193对空心莲子致病的最佳温度为25～30％；高湿条件下SF-193致病过程加快。SF-193对不同生长季节和不同生境下的空心莲子草均有较好的防除效果。     

拮抗细菌B-916培养液对水稻纹枯病菌的抗生活性及其抗菌物质的研究

拮抗细菌Ｂ－９１６培养液从原液至稀释４００倍的稀释液水稻纹枯菌的生长均有抑制作用,且浓度愈高,抑制作用愈强。培养液原液与纹枯菌对峙培养,形成的拮抗带宽度为６．７ｍｍ。用培养液处理Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ,菌核形成比未经Ｂ－９１６培养液处理的纹枯病菌（对照）推迟５２ｈ。把Ｂ－９１６培养液喷雾在水稻植株上能有效控制纹枯菌的侵染、蔓延,防治效果达５８．１％。Ｂ－９１６培养液用８０％饱和度的硫酸铵沉淀后透析,上清液完全丧失了抑菌作用,沉淀部分对纹枯菌的抑菌作用比未经硫酸铵处理的Ｂ－９１６培养液（对照）显著增强。由培养液对蛋白酶的敏感性试验结果推测,拮抗菌Ｂ－９１６培养液中抗菌物质的主要成分是蛋白质。     

旬阳烟区土壤养分分析研究

在旬阳烟叶主产区有代表性的村组取150个土壤样品进行了土壤养分分析,结果表明:土壤酸碱度(pH值)平均值为6.5,较为适宜烟草生产;有机质为16.01 g·kg-1,属中等水平;碱解氮(104 mg·kg-1)、有效磷(18.5 mg·kg-1)、速效钾(217 mg·kg-1)总体上处于正常或丰富水平;微量元素氯离子、有效铜、有效锌、有效锰、有效铁均处于适宜或较高水平,微量元素有效硼0.13 mg·kg-1属极低水平,97.3%的烟区有效硼含量处于较低或极低水平。此外,针对土壤养分含量情况,有针对性地提出旬阳烟区土壤改良措施及施肥对策,为烤烟大田施肥提供依据。