环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物检测中的应用研究进展

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种新型核酸扩增技术。自建立以来,该技术不断改进和发展,并广泛应用于病原微生物的检测,文章将就此展开综述。     

禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒（aMPV）F基因的保守序列设计并合成1对引物,利用RT—PCR可以扩增出1条725bp的片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了禽偏肺病毒病的RT—PCR检测方法。特异性试验表明,建立的RT—PCR检测方法能够从禽偏肺病毒疫苗毒株VIR115-B中扩增到725bp的特异性片段,而对H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该方法最低检出量的cDNA质量浓度为1．45μg／L;对山东省492份病料进行检测,阳性检出率为43．09％（212／492）,随机挑取11份进行克隆测序及序列分析,结果显示所扩增到的阳性产物均为B亚型的禽偏肺病毒。建立的禽偏肺病毒的RT—PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高的特点。     

日粮中添加高水平纳米硒对蛋鸡肝脏硒含量及抗氧化能力的影响

选取288只42周龄健康农大三号商品蛋鸡,随机分为6个组,每组设4个重复,在基础日粮中以亚硒酸钠的形式添加硒0.3 mg/kg;其余各组以纳米硒的形式分别添加硒0.3、0.5、2.5、5.0、10.0 mg/kg.试验期为60 d.结果显示:试验至30 d,添加0.5～10.0 mg/kg纳米硒能显著提高肝脏硒的含量,添加纳米硒能显著提高T-AOC活性(P<0.05),极显著提高T-SOD活性(P<0.01).试验至60 d,添加2.5～10.0 mg/kg纳米硒能极显著提高GSH-Px活性,添加0.5～10 mg/kg极显著降低NO含量(P<0.01).结果表明,日粮中添加高水平的纳米硒能提高蛋鸡肝脏的抗氧化能力.     

堆型艾美耳球虫早熟株免疫雏鸡后血清抗体水平动态变化的研究

用堆型艾美耳球虫早熟株对雏鸡进行一次免疫和二次免疫试验 ,研究雏鸡血清抗体的动态变化。试验结果显示 ,在一次免疫试验中 ,各剂量组雏鸡均在免疫后 2天血清抗体出现较高的 OD值 ,之后呈下降趋势 ,11天后逐渐上升 ,到 12～ 13天时出现第 2个峰值 ,各组间的血清抗体 OD值比较 ,3 0 0 0个卵囊 /只剂量组极显著 (P<0 .0 1)高于 10 0 0个 /只、2 0 0 0个 /只和 5 0 0 0个 /只剂量组。在二次免疫试验中 ,8日龄首免、14日龄二免组雏鸡的抗体水平动态变化整体呈上升趋势 ,峰值 (0 .3 75 )出现在二免后第 10天 ,其后稳定地维持在较高水平 (平均 OD值为 0 .3 5 ) ,并且其抗体水平显著地高于 6日龄首免、12日龄二免组 (P<0 .0 5 )。抗体水平动态变化表明 ,堆型艾美耳球虫早熟株有较强的免疫保护力 ,其免疫方式可选用一次免疫 ,剂量为 3 0 0 0个卵囊 /只 ,也可采用二次免疫 ,即 8日龄首免 (15 0 0个 /只 ) ,14日龄二免 (15 0 0个 /只 ) ,从抗体动态变化的稳定性看 ,二次免疫更佳     

通过病毒分离鉴定和基因检测首次发现虎流感

应用F81猫肾传代细胞，从高热、拒食和间有神经症状的死亡率病科中分离获得1株病毒，经形态学、理化学、生物学和血清学系统鉴定，证明为流感病毒。采用流感病毒核蛋白基因引物，对分离病毒及该虎病科进行RT－PCR扩增和序列分析，结果从分离病毒和虎病科中均扩增出与理论值大小相符的464bp基因片段；其序列与A、B、C3型流感病毒相比较，同源性分别为84．9％、35．0％、24．8％。由此说明，所分离病毒为A型流感病毒，命名为/蘧／哈尔滨（中国）／01／2002。用此分离病毒静脉接种于3月龄家猫3号，均出现与病虎相似的临床症状，其中1号耐过，2只死亡。死亡猫剖检变化与死虎相似，主要是呈肺炎病变，并可从病科中回收到所接种病毒。从此分离病毒为HA抗原，进行虎与猫血清的HI抗体检测，结果康复虎血清比其病初血清、康复猫血清比其接种前血清HI抗体均增高4倍以上，表明该病毒具有致病性，是引起该虎与试验猫发病甚至死亡的病原。     

Infections Investigation of ALV and REV in Guangxi Local Poultry Breeds and Sequence Analysis of gp85 Gene of ALV Isolates

In order to investigate the infection status of avian leukosis virus (ALV) and avian reticuloendotheliosis virus (REV) in the major local breeds of Qinzhou,Guangxi,totally 953 samples of egg white,cloaca swab and serum of Ma duck,Shitou goose,Tiejiao-Ma chicken,turkey and pigeon were collected from the representing flocks and detected by the commercial ELISA kits.ALV was isolated for the ALV p27 positive samples by culturing on DF-1 cells,and gp85 gene was sequenced.The results showed that the detections of ALV were negative in the samples except those of Tiejiao-Ma chicken,while REV antibody was found positive in Ma duck,Tiejiao-Ma chicken and turkey.The nucleotide sequences of gp85 gene of two isolates shared 94.5% identity with each other,and shared 86.9% to 94.9% with reference strains.The amino acid sequences of gp85 gene of two isolates shared 91.5% identity with each other,and shared 84.0% to 91.6% with reference strains.There were many variable sites in the hyper variable region hr1 and hr2,and the vr2 and vr3 variable regions were relatively conservative.Phylogenetic tree analysis showed that the two isolates shared the highest homology with SCAU11-XG strain.     

不同种牧草的产量和品质

在中国科学院海北高寒草甸定位站以一年生黑麦草(Lolium perenne)、小黑麦(Triticale hexaploide)、燕麦(Avena sativa)和垂穗披碱草(Elymus nutans)为研究对象,对其产草量、牧草营养品质进行测定,以探讨不同牧草的产量和品质。结果表明:小黑麦干草产量为1345.50 g·m^-2,显著高于一年生黑麦草(974.93 g·m^-2)、垂穗披碱草(301.75 g·m^-2)和燕麦(329.60 g·m^-2)。小黑麦产量是垂穗披碱草和燕麦干草产量的4~4.5倍,是黑麦草干草产量的1.4倍。垂穗披碱草粗蛋白(CP)含量显著高于一年生黑麦草和小黑麦(P<0.05),一年生黑麦草粗蛋白(CP)含量最小。单位面积粗蛋白(CP)产量、粗脂肪(EE)产量、中性洗涤纤维(NDF)产量和酸性洗涤纤维(ADF)产量以一年生黑麦草最高,显著高于小黑麦、垂穗披碱草和燕麦(P<0.05)。     

不同代谢能、粗蛋白和粗纤维水平对太湖鹅生长性能和屠宰性能的影响

为探索不同能量、蛋白和粗纤维水平对太湖鹅生长发育和屠宰性能的影响,将3种营养成分在不同饲养阶段均采用单因子设计,分为高、中、低3种水平。育雏期(0~4周龄)粗蛋白为17%、19%和21%;代谢能为10.5、11.0和11.5 MJ/kg;粗纤维为3.5%、5.0%和6.5%。育肥期(5~11周龄)粗蛋白为15.5%、16.5%和17.5%;代谢能为10.00、10.65和11.75 MJ/kg;粗纤维为5.0%、6.5%和8.5%。每种营养成分在分成3种水平时,其它营养成分为中等水平,营养成分相同的3个中等水平组合并为一组。将刚出壳雏鹅随机分为7组,每组3个重复,每个重复100只,公母各半。每组饲喂不同营养水平的日粮,观测各组增重、饲料转化比和屠宰性能。结果表明:在育雏期中等蛋白组增重显著大于其它组(P0.05),低蛋白组饲料转化比显著大于高蛋白组(P0.05);不同代谢能水平增重和饲料转化比差异均不显著(P0.05);不同粗纤维水平增重差异不显著(P0.05),高粗纤维组的饲料转化比显著大于其它组(P0.05)。在育肥期不同蛋白水平增重差异不显著(P0.05),各组间饲料转化比差异均显著(P0.05),低蛋白组最低,中等蛋白组最高;中等代谢能组增重显著高于其它组(P0.05),高代谢能组饲料转化比显著小于低代谢能组(P0.05);不同粗纤维水平的增重和饲料转化比差异均显著(P0.05),且均为中等粗纤维组最好,高粗纤维组最差。屠宰测定结果显示,仅见低能组的胸肌率显著高于高、中能组(P0.05),其它指标差异均不显著(P0.05)。建议太湖鹅育雏期日粮采用19%粗蛋白质、10.50 MJ/kg代谢能和3.5%粗纤维为宜;育肥期日粮采用15.5%粗蛋白、10.65 MJ/kg代谢能和6.5%粗纤维为宜。     

富硒女贞子粗多糖对小鼠免疫功能的影响

从富硒女贞子及女贞子中提取粗多糖,探讨其对小鼠免疫功能的影响。将90只小鼠随机均分为3组:对照组、富硒女贞子粗多糖组、普通女贞子粗多糖组。对照组灌服生理盐水,试验组小鼠灌服粗多糖液,灌服2次,每次连续5 d。2次灌胃的第3天注射卵清蛋白,二免后测定胸腺脾脏指数;MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平;ELISA试剂盒检测血清中IL-2、IL-4、IFN-γ生成水平及相应抗体生成水平。结果显示:与对照组相比,试验组脾脏和胸腺指数明显升高,脾淋巴细胞增殖作用显著提高;IL-2、IL-4、IFN-γ生成水平明显提高,其中IFN-γ与对照组存在显著差异;而对特异性卵清抗体生成影响不大。这表明富硒女贞子粗多糖较普通女贞子粗多糖能更好地促进机体非特异性免疫及细胞免疫,从而增强机体免疫功能,在特异性体液免疫的作用方面则没有表现出明显的规律性,还需进一步研究。     

口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定操作程序的确立

为优化用于口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定的改良Lowry法,进而确立口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定的操作程序,探索了有机溶剂破乳剂、酚红以及丙酮沉淀对测定结果影响。结果表明：样品中含酚红和有机溶剂均导致测定值较标准值高;有机溶剂破乳后,水相样经过丙酮沉淀测定值较标准值低;丙酮直接沉淀疫苗后测定蛋白质值与标准值符合度最高,丙酮沉淀回收率随蛋白浓度升高而升高,回收率在90％～100％之间。试验首次确立了改良Lowry法检测口蹄疫灭活疫苗中蛋白质含量的操作程序为丙酮直接沉淀疫苗后测定蛋白质浓度。并成功应用于口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量的测定。