猪带绦虫组织蛋白酶B基因的克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索猪带绦虫组织蛋白酶B基因克隆、原核表达及抗血清制备的方法。[方法]根据从Gene DB获得的猪带绦虫组织蛋白酶B的基因序列设计特异性引物,以猪带绦虫的c DNA为模板,扩增出猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框。将去掉信号肽的部分进行了原核表达,用重组蛋白免疫青紫蓝灰兔,并制备高效价抗血清。[结果]成功克隆了猪带绦虫组织蛋白酶B基因的开放阅读框序列,将其命名为Tscp B,长度为1 074 bp,编码357个氨基酸,理论蛋白分子质量约为39.71 ku,具有组织蛋白酶B的特征结构域。采用大肠杆菌原核表达系统对目的蛋白进行大量表达,成功获得了大小约38 ku的猪带绦虫组织蛋白酶B的重组蛋白,此目的蛋白以包涵体的形式存在。Western blotting表明,猪囊尾蚴病阳性血清可以与纯化的重组蛋白发生特异性结合,说明被猪囊尾蚴感染过的猪血清中存在组织蛋白酶B的抗体。[结论]猪带绦虫组织蛋白酶B重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

中华绒螯蟹白斑症病毒病的诊断

[目的]对江苏省吴中地区养殖池塘患病的中华绒螯蟹进行诊断。[方法]结合临床流行病学调查和分子生物学鉴定,对江苏省吴中地区发病的中华绒螯蟹进行实验室检测与鉴定。参考Gen Bank中白斑症病毒(WSSV)的基因序列设计1对特异性引物,以从中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉等组织提取的DNA为模板,进行PCR扩增。[结果]经过解剖观察,发现病蟹内脏器官无明显变化。从病蟹的肝胰腺和肌肉中未分离到致病菌。通过PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物,测序比对显示扩增条带的基因序列与WSSV的基因序列同源性高达99.6%。病理切片显示鳃和肝胰腺可见大量细胞核肿大细胞,与WSSV引起对虾组织的病变相一致。[结论]经初步诊断,确定引起中华绒螯蟹发病死亡的病原为WSSV。     

褐藻提取物与复合磷酸盐对中国对虾保水效果的比较研究

比较了市售褐藻提取物与水产品加工中常用复合磷酸盐的保水效果。选择浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率和出品率为主要指标,全面衡量保水剂的保水效果,并通过测定蒸煮后虾仁的质构和色差进一步评价保水剂对虾仁品质的影响。研究结果表明,经粘度为55 mPa·s的1%褐藻胶低聚糖浸泡处理的虾仁其浸泡增重率为11.7%,显著高于3%复合磷酸盐处理的6.3%(P<0.05),且冻藏10 d后其解冻损失率明显低于复合磷酸盐处理的虾仁,蒸煮损失率和出品率无明显差异(P>0.05);冻藏20 d后解冻损失率仍可保持浸泡增重的7.2%,而复合磷酸盐为5.1%,其蒸煮损失率虽高于复合磷酸盐,但仍低于其它处理组,出品率与复合磷酸盐无明显差异,且蒸煮后虾仁的色泽较鲜艳,而复合磷酸盐处理的虾仁略微发白。由此可见,粘度为55 mPa·s的褐藻胶低聚糖对虾仁的保水效果可与复合磷酸盐相媲美,且在某种程度上保水效果优于复合磷酸盐。因此,粘度为55 mPa·s的褐藻胶低聚糖有望开发成新型安全高效的无磷保水剂。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

湿地生态系统健康评价研究进展

对湿地生态系统健康评价,将为生态系统健康诊断和生态修复提供决策依据。本文归纳了湿地生态系统健康的概念,回顾了国内外湿地生态系统健康评价的历史和现状,按照湿地特征、湿地功能和社会经济指标等三方面指标对湿地生态系统健康评价指标进行分类和归纳,并指出了目前湿地生态系统健康评价存在的问题及今后的研究趋势。     

猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

 根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的4     

猪带绦虫六钩蚴45W基因家族分子克隆

  利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从激活的猪带绦虫六钩蚴克隆到45W基因家族。通过测序及DNAStar软件分析证实，共得到8个A型转录本、3个与A型转录本相应的B型转录本和4个其它B型转录本，以及1个C型转录本，提示45W相关基因可能更多。在本研究中，发现45W-4B非常保守，有望以此为基础研制出有效的抗猪囊尾蚴病的疫苗。在大肠杆菌中以融合蛋白（GST）的形式对经改造的A型转录本（A3）和B型转录本（B2）进行表达，SDS-PAGE证明，A3呈可溶性表达；B2的表达产物主要形成了包涵体，用强变性剂（6M尿素）处理后再经SDS-PAGE，证明B2也得到了高效表达。Western分析结果表明，二者均与囊虫患者血清不反应或反应很弱；B2能与猪抗六钩蚴血清反应，说明B2可能具有免疫反应性，且其抗原表位可能是线性的。从预测的结果看，猪带绦虫45W蛋白可能是跨膜糖蛋白，跨膜区位于C末端，在它的结构中可能还存在FnⅢ组件。同时，A3和B2蛋白结构中还存在Cn-Em重复单元，以及由16～17个氨基酸构成的α-螺旋的结构单元。在45 W蛋白的加工过程中，磷酸化修饰可能是一项重要内容。由此推测，45W蛋白的作用很复杂，可能在调节基因的表达和维持正常的细胞形态等过程中发挥重要的作用。     

柔嫩艾美耳球虫LZ株MIC-5基因的克隆与表达

提取柔嫩艾美耳球虫兰州株孢子化卵囊总RNA,运用RT-PCR技术扩增Et MIC-5基因片段进行测序,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达.结果表明,该基因片段长918 bp,编码306个氨基酸.与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫Houghton株MIC-5基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性为99.2%和99.6%.在推导的MIC-5氨基酸序列中,第15~89、90~160、173~242和245~306位保守的cys残基形成4个Apple样结构域(A-domain),推测该蛋白可能在虫体与宿主细胞的黏附中起重要作用.转化重组质粒pETMIC-5的BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blot分析证实目的蛋白成功表达,重组蛋白的表达量可占菌体蛋白的15.2%.     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

贝类对重金属的吸收转运与累积规律研究进展

随着含重金属农药的施用、含重金属煤炭、石油的燃烧以及含重金属工业废水的大量排放,重金属对环境特别是水生生物的污染愈来愈严重,形势十分严峻。重金属的危害很大,通过食物链及生物的富集作用产生蓄积,人类食用了这些含重金属超标的鱼贝类等生物会造成不同程度的中毒现象[1-