猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达

采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确.用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR技术确定目的蛋白的表达情况.结果表明,在转染重组质粒48 h后能观察到绿色荧光,表明在BHK细胞中成功地表达了猪带绦虫dUTPase与pGFP-C1的融合蛋白,为下一步重组dUTPase酶活性的研究奠定了基础.     

奶牛源金黄色葡萄球菌新疆流行株生物被膜形成及相关基因的分布与转录水平

[目的]了解金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)临床分离株的生物被膜形成情况及黏附素和ica操纵子与生物被膜形成能力的相关性,为系统掌握新疆地区奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科学依据.[方法]收集临床分离鉴定的164株SA新疆流行株,采用结晶紫半定量黏附试验(MPA)测定各流行株的体外生物被膜形成能力,同时通过PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对SA生物被膜形成相关基因转录水平进行检测分析.[结果]164株奶牛源SA新疆流行株的生物被膜阳性率为86.0%(141株),其中弱(+)生物被膜形成有69株(占42.1%)、中等(++)生物被膜形成有38株(占23.2%)、强(+++)生物被膜形成有34株(20.7%).在141株MPA阳性SA分离株中,clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因检出率分别为83.7%(n=118)、58.9%(n=83)、75.2%(n=106)、78.7%(n=111)、75.9%(n=107)、58.9%(n=83)、90.1%(n=127)、79.4%(n=112)和100.0%(n=141);ica基因(icaA、icaC和icaD)检出率总体上高于其他生物被膜形成相关基因,且生物被膜形成能力强(+++和++)的菌株尤为明显;clfB、fnbA、cna和fib基因检出率则表现为MPA阴性菌株高于MPA阳性菌株.9个生物被膜形成相关基因中有7个基因(clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD)在强(+++)生物被膜形成能力SA分离株中的表达量显著上调(P<0.05).[结论]奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成率高,生物被膜形成相关基因携带率也较高,其中clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD基因的表达与SA生物被膜形成密切相关.     

牛源MRSA新疆流行株的分离鉴定及spa基因多态性分型

[目的]明确新疆地区牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)流行株的流行特点,为有效防控新疆奶牛乳房炎和子宫内膜炎提供参考依据.[方法]采用分离培养、生化鉴定、药敏试验等方法对牛源MRSA进行鉴定,并以PCR扩增牛源MRSA新疆流行株spa基因的X区,测序结果列提交至spa分型数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行spa基因多态性分型.[结果]从221份样品中共检测出71株金黄色葡萄球菌,其中对苯唑西林抑菌直径小于10 mm的有8株;而以mecA引物进行PCR扩增,发现扩增结果呈阳性的有13株,MRSA检出率为18.3%.spa基因分型有4种,分别为t779、t2883、t13751和t1939,其中5株为t779(r08),4株为t2883(r07-r23-r21-r17-r34),2株为t13751(r07-r23-r12-r21-r17-r12),2株为t1939(r07-r23-r02-r34),即t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型.[结论]MRSA在新疆不同地区均有分布,且其耐药情况不断变化,以t779(r08)为MRSA新疆流行株的主要spa基因分型.     

母源抗体对猪口蹄疫疫苗免疫应答的影响

用液相阻断ELISA(Liquid phase blocking ELISA,LPB-ELISA)和正向间接血凝(Indirect hemagglutination test,IHAT)2种血清学试验方法对规模化饲养猪群仔猪的口蹄疫母源抗体、母源抗体的传递途径、消长规律、母/仔代特异抗体相关性及母源抗体对口蹄疫疫苗免疫的影响进行了研究和分析。结果表明,2种血清学方法均没有从未吸吮初乳的新生仔猪中检出特异抗体;在吸吮初乳后的仔猪血清中可检出特异性抗体,并于10日龄左右抗体效价升至峰值,而后随着日龄的增加,特异性抗体的效价呈明显的线性下降,母源抗体半衰期约为10～20d,至45～60日龄母源抗体效价降至不完全保护带(lgX<1.8)或更低;仔猪母源抗体水平与母体特异抗体水平呈正相关。通过对不同日龄仔猪接种口蹄疫疫苗后抗体水平检测发现,仔猪体内较高水平的母源抗体对疫苗免疫应答具有明显或一定的负面影响。     

Development of a Rapid Gold lmmunochromatographic Strip Test for the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease Virus

为了兽医基层工作人员能够快速诊断口蹄疫病原,与其他传染病做鉴别诊断,有必要建立一种快速、简便区分它们的胶体金免疫层析方法.本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金.将纯化的Asia 1/China/05流行毒株12S偶联抗原的兔抗体制备免疫胶体金,喷免疫胶体金于玻璃纤维制成金标垫.将纯化A/AF72流行株12S偶联抗原的兔抗体和适量O/China/99流行毒株12S偶联抗原的兔抗体混合固定于硝酸纤维素膜上作为检测带.将羊抗兔抗体固定在硝酸纤维素膜的不同区域作为质控带,并组装成口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条.利用其对阴性参考样品、各型阳性参考样品、已知背景的田间样品进行检测.灵敏度试验结果显示:建立的试纸条方法敏感性高、可检测到病毒最低含量为0.98×104 LD50;特异性试验显示:在检测与口蹄疫临床症状相似病原——猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)抗原时无交叉反应;重复性试验显示:不同批次间、同一批次内检测结果完全一致;符合性试验显示:检测国家口蹄疫参考实验室已确定口蹄疫病毒血清型的样品90份,阳性符合率、阴性符合率分别为96.70％、100％.本试验研发的口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条具有很好的灵敏度、特异性、重复性和符合性,适合国内流行的口蹄疫病原的鉴别诊断.     

偶蹄家畜FMDV受体通用亚基αv基因的分子特征及其进化关系

已发现至少有αvp1、αve3、αvB6、αvp84种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。结果显示,羊、牛、猪、双峰驼的αv亚基基因的编码区分别含有3147、3147、3141、3165个核苷酸,分别编码1048、1048、1046、1054个氨基酸,信号肽均由氨基端30个氨基酸组成,跨膜区、胞浆区均分别由29、32个氨基酸组成;胞外区分别由957、957、955、963个氨基酸组成。羊、牛、猪、双峰驼αv亚基基因在Gen—Bank中的登录号分别为EU367989、DQ871215、EF474019、EU367990。同源性分析表明,信号肽变异最大,胞外区次之,跨膜区和胞浆区比较保守;进化树表明,与灵长类、啮齿类、奇蹄类、禽类、食肉类等口蹄疫非易感物种相比,口蹄疫易感动物羊、双峰驼、猪、牛等偶蹄家畜αv亚基的亲缘关系较近,处于同一进化分支。这表明受体αv亚基可能与FMDV的宿主范围和组织嗜性有关。     

可食疫苗研究进展

对动物免疫成功与否，要看能否将易感群体减少到传染病可流行的阈值以下，因此免疫接种的广泛性是控制人盲疫病流行的重要因素之一。尽管医药科学已有飞速发展，但是由于疫苗的生产、配送等方面的限制，全球推广免疫接种仍然面临着巨大的困难。开发使用方便、廉价、高效疫苗，对控制全球各种疾病的爆发和流行有着深远的意义。目前，广泛研究的可食疫苗（Edible Vaccine）为解决这一难题提供了新的思路和方法。可食疫苗不仅有使用方便、安全的优点，而且一旦在转基因植物、动物或微生物中研究推广，可以立即为落后贫困地区人畜疫病防疫提供廉价可行的可食疫苗。本文主要综述目前广泛研究的几种可食疫苗的研究进展，主要包括：转基因植物可食疫苗、沙门氏菌携带的重组和DNA核酸可食疫苗、其他微生物携带或重组的可食疫苗，以及转基因动物生产的可食疫苗。     

牦牛α-干扰素基因的克隆及其原核表达的研究

植物血凝素（PHA）诱导培养牦牛外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT—PCR技术扩增牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ基因,分别经PCR、酶切鉴定及测序分析后,再分别构建原核表达重组质粒,用SDS-PAGE和Westernblot分析IPTG诱导表达的重组蛋白。序列分析表明,牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为570bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-A参考序列同源性为94．4％,与黄牛INF-α-B基因（M10953）的同源性最高,为97．0％;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94．2％,与黄牛IFN-δ—1基因（XM-871297）的同源性最高,为96．1％。分子遗传进化树分析表明牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ与黄牛、奶牛和水牛亲缘关系最近,与猪、马、人的次之,与其它动物都较远,说明这两基因均具有种属差异性。诱导表达重组蛋白分析表明,pGEX4T／IFN-α-A和pGEX4T／IFN-α-Ⅱ在大肠杆菌中得到了正确表达,均可表达约44ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,且具有与抗血清发生反应的生物活性。     

猪囊尾蚴及其培养细胞的超微结构观察

应用透射电镜和扫描电镜观察了采自猪体的猪囊尾蚴及其体外培养细胞的形态结构特征。猪囊尾蚴的基本结构包括皮层、间质层和实质区。皮层密布微绒毛;内部是实质区,含光面内质网,大量囊泡和圆形空泡。线粒体多分布在基质区的近基膜处。皮层以基膜与间质分开。间质层为网状纤维样,并形成分支深入实质区,起支架作用。肌组织位于间质层中,间质层向内为实质区,有实质细胞、皮层细胞、成肌细胞及成石灰颗粒细胞。排泄系统中除不同孔径的排泄管外,还有三五成群的焰细胞与毛细管相通。体外培养的细胞结构与体内自然生长的无明显差异,猪囊尾蚴培养细胞的内部细胞器较其体细胞清晰,与体细胞相比培养细胞有些细胞内部细胞器减少。猪囊尾蚴细胞的外部形态主要以圆形、椭圆形为主,多数细胞表面有凹槽、脊及绒毛。     

牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体.BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状,给养牛业造成重大的损失.其致病机理非常复杂,给该病的治疗和根除带来极大的困难.随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究,人们在BVDV分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展.就此,作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述,有助于阐明BVDV致病和在体内持续存活的机制,为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策.