鸡PD-1单克隆抗体的制备及生物学功能研究

试验旨在筛选并制备鸡PD-1单克隆抗体,对该单克隆抗体的免疫学特性、结合活性及其对鸡PD-1/PD-L1信号通路激活的阻断作用进行初步研究。运用杂交瘤细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,采用ELISA方法、Ig抗体亚型鉴定试剂盒、Western blotting鉴定抗体的免疫学特性,利用间接免疫荧光技术及流式细胞术检测筛选单抗与鸡PBMCs的结合情况,应用该单抗与IBDV感染7 d后的鸡PBMC细胞作用,利用实时荧光定量PCR技术检测IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况。结果显示,试验获得1株特异、稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为PD-1-D05。该单克隆抗体的亚型属于IgG1,杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为1：2¹¹和1：2.048×10⁵。ELISA和Western blotting检测结果表明,PD-1-D05单抗能与免疫原发生特异性反应,与pET-28a （+）、Rosetta菌株蛋白提取液上清及无关蛋白无交叉反应。间接免疫荧光及流式细胞术检测结果显示,PD-1-D05单克隆抗体能与鸡PBMC特异性结合,且IBDV感染7 d后的PBMC经单抗处理后,IL-2表达量显著升高（P<0.05）,IFN-γ转录水平显著下降（P<0.05）,IL-6表达水平较IBDV攻毒组细胞虽有所下降,但并无统计学差异（P>0.05）。结果表明,试验成功筛选并制备了能够稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的细胞株,所获得的PD-1单克隆抗体具有良好的免疫学特性,该单抗能够特异性识别鸡PD-1分子并与鸡PBMC细胞特异结合,并在一定程度上恢复由于IBDV感染导致的PD-1/PD-L1信号通路激活引发的免疫调节相关细胞因子IL-2、IFN-γ的异常表达。     

一种从藤粉蝶分离的微孢子虫的生物学特性和分子系统发育研究

从广州市萝岗桑园周边捕捉到的野外昆虫藤粉蝶(Delias pasithoe)成虫体内分离到1株微孢子虫,经人工接种可在家蚕体内全身性寄生。用透射电子显微镜观察到该微孢子虫为双核,极丝11～12圈,极丝同型,基本符合Nosema属微孢子虫超微结构特征。该微孢子虫在其生活史发育过程中以偶倍数核为主,以二分裂方式增殖,形成双核孢子,发育周期为108 h。基于SSU rRNA和rRNA ITS序列的相似性比较和系统进化分析进一步证实该微孢子虫与Nosema属亲缘关系最近,应被分类为Nosema属‘true’Nosema亚群。     

华南蚕区蚕沙产地无害化和肥料化处理技术体系构建思路

调查华南蚕区现有的蚕沙处理主要有分散简易堆肥、沼气发酵和集中资源化利用处理3种模式。针对该蚕区高温多湿的环境,以及一年多次养蚕,蚕沙生产量大的情况,提出因地制宜,采用简易蚕沙池改造升级、小型设施堆肥处理、小规模集约化堆肥处理等多种模式相结合的蚕沙好氧堆肥处理技术,并通过蚕沙堆肥过程与条件的控制,达到蚕沙病原菌灭活无害化、蚕沙堆肥发酵完全熟化和蚕沙作为桑园肥料应用无风险的目的,构建蚕沙产地无害化和肥料化处理技术体系。     

饲粮铜水平对育成期蓝狐生长性能、营养物质消化率及氮代谢的影响

本试验旨在研究饲粮铜水平对育成期蓝狐生长性能、营养物质消化率及氮代谢的影响。试验选择健康55日龄蓝狐100只,随机分成5组,每组20个重复(公母占1/2),每个重复1只。Ⅰ～Ⅴ组蓝狐分别饲喂铜含量为7.89、20.00、40.00、80.00、160.00 mg/kg的试验饲粮。预试期7 d,正试期60 d。结果表明:1)Ⅲ组公狐的平均日增重显著高于Ⅴ组(P<0.05),料重比显著低于Ⅴ组(P<0.05);Ⅲ组母狐的平均日增重显著高于Ⅰ组(P<0.05),料重比显著低于Ⅰ组(P<0.05)。2)Ⅲ组公狐的干物质消化率、蛋白质消化率极显著高于Ⅱ、Ⅴ组(P<0.01),显著高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅲ组公狐的脂肪消化率极显著高于其他4组(P<0.01),其他各组间差异不显著(P>0.05);各组母狐之间干物质消化率、蛋白质消化率均无显著差异(P>0.05),Ⅰ组母狐的脂肪消化率极显著低于Ⅲ组(P<0.01),显著低于Ⅳ、Ⅴ组(P<0.05)。3)Ⅲ组公狐的氮沉积、净蛋白质利用率极显著高于Ⅴ组(P<0.01),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组公狐的蛋白质生物学价值极显著高于Ⅴ组(P<0.01);Ⅲ组母狐的氮沉积、净蛋白质利用率和蛋白质生物学价值显著高于Ⅱ组(P<0.05),其他各组间差异不显著(P>0.05)。由此可见,当饲粮铜水平为40.00 mg/kg时,饲粮营养物质消化率、氮沉积、净蛋白质利用率、蛋白质生物学价值较为理想,且可获得较佳的生长性能。     

鸡HSP90AA1基因SNP检测及启动子区CpG岛的甲基化研究

试验旨在获得鸡热休克蛋白90α(HSP90AA1)基因序列并分析其基因结构和相关遗传变异,检测HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP90AA1基因在肌肉组织生长发育中的作用。以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,利用PCR扩增鸡HSP90AA1基因组序列;通过基因测序寻找该基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点;使用在线软件MethPrimer预测鸡HSP90AA1基因中CpG岛的位置;应用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP90AA1基因的甲基化差异。结果显示,在鸡HSP90AA1基因组中共发现7个SNPs位点,分别位于启动子区(A-189G,C-109T)、第1外显子(A+6G)、第2外显子(C+343T)、第2内含子(A+634G、A+836G)和第7内含子(A+3449G);鸡HSP90AA1基因包含10个外显子和9个内含子,其启动子区存在1个CpG岛,位于-1 802～-469bp处;在HSP90AA1基因启动子区共检测了42个CpG位点的甲基化水平,文昌鸡和北京油鸡中分别有9个(CpG_16.17.18、CpG_21.22.23、CpG_32.33和CpG_57)和4个CpG位点(CpG_1、CpG_5.6和CpG_57)在胸肌生长发育过程中发生甲基化改变。结果表明,文昌鸡与北京油鸡HSP90AA1基因序列信息和启动子区CpG岛的甲基化水平不同,这可能导致两种鸡对于应激反应具有不同的耐受程度。以上试验结果将为文昌鸡和北京油鸡生长发育规律、系统选育等方面的研究提供表观遗传学依据。     

伊维菌素微乳无菌检查方法学的研究

本试验旨在对伊维菌素微乳制剂进行无菌检查方法学验证和无菌检查试验,确认本试验所用的方法适用于该制剂的无菌检查。按《中国兽药典》2005版一部(附录118)所载"无菌检查法"项下进行试验,通过对阳性对照菌、不同量冲洗液等条件的选择,采用薄膜过滤法对10瓶供试品(每种试验菌的样品量)进行检测,建立了无菌检查方法。经方法验证,用400mL 0.1%蛋白胨水溶液冲洗后,含供试品容器中的7个阳性菌试验组与阳性菌对照组相比均生长良好,说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,可以用该方法进行供试品的无菌检查。对3批供试品进行无菌检查,阳性对照菌均在24h内生长良好,阴性对照均澄清,无菌生长,3批供试品均澄清,无菌生长,无菌检查试验结果符合规定。     

不同温度下圆叶决明降解过程红壤可溶性氮及氮水解酶动态变化研究

为了探明圆叶决明（Chamaecrista rotundifolia）降解过程果园红壤供氮水平的变化规律,本研究采用模拟培养试验,研究15℃和25℃培养果园红壤硝态氮、铵态氮、可溶性总氮、可溶性有机氮含量的变化及脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶活性的变化。结果表明,圆叶决明降解过程果园红壤4种可溶性氮含量均显著提高,且在培养140 d达到最大值,25℃培养的效果更佳。其中,可溶性总氮、可溶性有机氮和硝态氮含量随时间的动态变化可用三次曲线方程来拟合。圆叶决明降解过程还能显著提高脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶的活性,其中蛋白酶活性和脲酶活性的变化可用指数方程和三次曲线方程来拟合。本研究认为圆叶决明降解过程可提高果园红壤可溶性氮含量,因此可通过翻压圆叶决明提高土壤的供氮水平。     

饲喂方式对德州驴生长性能、营养物质消化率和盲肠微生物多样性的影响

本试验旨在研究饲喂方式对德州驴生长性能、营养物质消化率和盲肠微生物多样性的影响。选择体重[(215±10)kg]相近、2周岁左右的健康德州公驴15头,随机分为C1组(饲喂方式为先粗后精)、C2组(饲喂方式为先精后粗)、C3组[饲喂方式为全混合日粮(TMR)],每组5头,预试期7 d,正试期75 d。结果显示:1)C2组平均日增重极显著高于C1和C3组(P≤0.01),C1组干物质和酸性洗涤纤维消化率以C1组最高,C3组次之,C2组最低,C1组与C2组间存在显著差异(P≤0.05)。2)饲喂方式对德州驴盲肠微生物组成有一定影响。在门水平上,各组盲肠微生物均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主(二者占比>75%),其次为螺旋体菌门(Spirochaetes)、变形菌门(Proteobacteria)和纤维杆菌门(Fibrobacteres),且C2组厚壁菌门相对丰度高于C1组和C3组;在属水平上,将401个属中相对丰度低于1%的属聚为其他(占比>75%)后,各组均以其他为优势菌属;随后,C1组以螺旋体科未定义属(unidenti⁃fied⁃Spirochaetaceae)和厌氧孤菌属(Anaerovirbrio)为主,C2组以厌氧孤菌属、链球菌属(Strepto⁃coccus)和螺旋体科未定义属为主,C3组则以乳酸杆菌属(Lactobacillus)和螺旋体科未定义属为主。3)通过UPGMAA聚类树、主成分分析和物种差异性分析发现,3组德州驴盲肠微生物组成不同,且C2组与其他2组差别较大,C1组和C3组可聚为一类。综上可知,饲喂方式可极显著影响德州驴的平均日增重,显著影响干物质和酸性洗涤纤维消化率,并可改变盲肠微生物组成。     

光周期变化对山羊褪黑素分泌及免疫和抗氧化功能的影响

光周期可以影响动物体内褪黑素(MLT)的分泌,而MLT能参与机体多种生理功能的调节。本试验旨在研究光周期对山羊MLT分泌、免疫和抗氧化功能及相关基因表达的影响。将18只6月龄雌性绒山羊随机分为3组:对照(CG,自然光周期)组、短光照(SDPP,光照8 h/d,黑暗16 h/d)组和渐减光照(SIPP,光照时间从16 h/d逐渐缩短到8 h/d)组。试验期为60 d。结果表明:与对照组相比,1)在试验第30天,SDPP显著增加了血清MLT含量(P<0.05),在试验第60天,SIPP显著增加了血清MLT含量(P<0.05);2)在试验第30天,SDPP组血清总超氧化物歧化酶(T⁃SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性显著升高(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05),而SIPP组上述指标均无显著变化(P>0.05);在试验第60天,SDPP组和SIPP组血清T⁃SOD、GPx和CAT活性均显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05);3)在试验第30天,SDPP显著提高了血清免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-1β(IL⁃1β)和白细胞介素-2(IL⁃2)含量(P<0.05);在试验第60天,SDPP和SIPP均显著提高了血清IgG含量(P<0.05),此外,SDPP显著提高了血清IL⁃1β、IL⁃2和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.05),而SIPP仅显著提高了血清IL⁃1β含量(P<0.05);4)在基因表达方面,在试验第30天,SDPP显著上调了白细胞中SOD1、GPx1、GPx4、CAT、核转录因子2(Nrf2)、IL⁃1β、和IL⁃2基因相对表达量(P<0.05);在试验第60天,SDPP组白细胞中SOD1、CAT、GPx4、IL⁃1β和IL⁃2基因相对表达量显著提高(P<0.05),SIPP组白细胞中SOD1、GPx1、CAT、IL⁃1β和IL⁃2基因相对表达量显著提高(P<0.05)。上述结果表明,持续短光照能分泌更多的MLT,提高山羊的免疫和抗氧化功能。