CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展

概括了CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理,分析了该系统的不足,重点阐述了该技术在林木基因组编辑中的应用,并对CRISPR/Cas9系统的未来研究趋势进行了展望。     

长薄鳅恶臭假单胞菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是广泛分布于土壤、水体中的一种条件致病菌,可感染两栖类、鱼类和甲壳类等多种水生动物。2017年8月,四川省西昌市某养殖场的长薄鳅出现一种以体表溃烂、鳍条出血为主要特征的传染病。为探究其病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌表型特征测定、16S rRNA与gyrB基因序列分析。从病鱼肝、脾、肾中分离到优势菌株(BMH170820),人工感染试验证实了其病原性。根据其菌落形态、生理生化特性,结合16S rRNA与gyrB基因序列分析鉴定其为恶臭假单胞菌。组织病理学观察发现,其感染长薄鳅对鳃、肾、肝、心、脾与消化道等多处组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,致全身多器官功能障碍而死亡。药物敏感试验显示,该菌对新霉素、氧氟沙星以及强力霉素等敏感,而对阿莫西林、头孢氨苄与氟苯尼考等耐药。     

桥接治疗急性缺血性脑卒中患者的血管再通率及远期神经功能恢复分析

目的 探讨重组组织型纤溶酶原激活物（rtPA）静脉溶栓联合血管内介入治疗（即桥接治疗法）对急性缺血性脑卒中患者的治疗效果。方法 选取我院（2015年1月-2018年1月）收治的100例急性缺血性脑卒中患者进行回顾性分析,根据治疗方法分为观察组47例（桥接治疗法）、对照组53例（rtPA静脉溶栓疗法）,对比两组治疗后的血管再通率、神经功能恢复情况。结果 观察组前循环梗死血管（颈内动脉、大脑前动脉、大脑中动脉）再通率91.49%,对照组前循环梗死血管再通率50.94%,两组比较差异具有统计学意义（P<0.01）;观察组治疗14 d、治疗28 d、治疗3个月,神经功能缺损（NIHSS）评分均显著的低于对照组（P<0.01）;根据mRS标准,观察组的预后良好87.23%,对照组预后良好52.83%,两组比较差异具有统计学意义（P<0.01）;观察组的并发症发生率8.51%,对照组并发症发生率16.98%,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 桥接治疗对缺血性脑卒中患者的效果优于rtPA静脉溶栓疗法,对于患者远期神经功能恢复具有显著效果。     

闽楠天然次生林林木综合竞争指数研究

以江西省吉安市闽楠天然次生林作为研究对象,通过八邻域平移法确定对象木,分别采用四邻体法、Voronoi图法选取竞争木,并基于Hegyi简单竞争指数重新构建含胸径、树高、冠幅及林木间距等因子的综合竞争指数,利用Pearson相关分析法和曲线拟合比较分析不同方法选取竞争木的简单竞争指数与综合竞争指数的优劣。结果表明:1)简单竞争指数和综合竞争指数与胸径、树高及冠幅之间均呈极显著负相关(P<0.01);2)综合竞争指数与胸径、树高及冠幅的相关性和拟合度均高于简单竞争指数;3)基于Voronoi图法构建的简单竞争指数和综合竞争指数与胸径、树高及冠幅的相关性和拟合度均高于基于四邻体法构建的简单竞争指数和综合竞争指数。研究结果可为闽楠天然次生林的合理经营与保护等措施的制订提供参考依据。     

斑点叉尾鮰暴发性出血溃疡症的病理学研究

【目的】探究两起斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus暴发性体表出血溃疡症的发病病因和病理特征。【方法】利用湿片法对鳃组织和体表黏液进行压片,观察寄生虫寄生情况。从发病鱼的肝脏、脾脏和肾脏中分离病原菌,检测细菌感染情况;利用PCR法检测患病斑点叉尾鮰的肝、脾、肾混合组织匀浆中斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)的携带情况。运用组织病理学方法观察病鱼的病理损伤特点,综合分析并推测该病的致病原因。【结果】该出血溃疡症的靶器官主要为脾脏、肾脏、肝胰脏、肠道以及皮肤肌肉。主要表现为严重的血管反应,实质细胞可见肿胀、变性、坏死;而胃、脑和心脏病变较轻,仅有轻微的炎症;鳃丝、眼球和鳔等未见明显病变。所有的患病个体均出现中度至重度出血性坏死性脾炎、中度肾炎、轻度至中度坏死性肝胰腺炎和肠炎。患病斑点叉尾鮰体内未检测到寄生虫、细菌以及CCV。【结论】综合病理学、细菌学和病毒学检测结果,推测此次斑点叉尾鮰暴发性疾病由某种非CCV的病毒感染所致,温度应激可能是引发该病的条件诱因。     

外源添加氨基酸对兽疫链球菌产透明质酸的影响

兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)是一种营养缺陷型菌株,其生长代谢需要外源添加各类营养因子。通过在兽疫链球菌发酵对数生长初期外源添加氨基酸的方式研究其对透明质酸生产的影响。结果表明,外源添加氨基酸对透明质酸的生产具有显著的促进作用。笔者初步研究了当添加质量浓度为0.5 g/L时,18种常见氨基酸对透明质酸产量的影响。在此基础上,在18种氨基酸中选取苯丙氨酸和丝氨酸对透明质酸合成进行浓度优化实验,结合细胞生长和代谢产物分析,更进一步研究氨基酸对透明质酸合成的影响。结果表明,苯丙氨酸和丝氨酸添加质量浓度分别为0.5 g/L和0.5 g/L时,透明质酸产量提高最大,与对照相比分别提高了18.05%和17.44%,菌体浓度均没有增加,但是乳酸浓度分别降低了9.93%和15.80%,说明氨基酸的添加不是通过增加菌体量来提高透明质酸产量,而是改变了碳源流向,减少了乳酸积累,使得透明质酸产量显著提高。本研究为高产透明质酸的发酵工艺提供了借鉴与依据。     

普通质粒载体与Semliki森林病毒复制子载体表达GHRH的比较

新一代Semliki森林病毒RNA复制子源自甲病毒属Semliki森林病毒的基因组,它克服了一些现有的DNA和RNA载体表达效率低的缺点。复制子保留了编码病毒复制酶的基因,结构基因被外源基因所取代。复制酶能够使RNA在胞质中高水平的复制以及外源基因高水平的表达。为了评价SFV复制子载体提高外源基因表达的效力,本研究首先对pIRES-neo表达载体用BamHⅠ酶切和去磷酸化,连接LacZ基因,构建了普通真核表达载体pIRES-neo-LacZ。然后采用脂质体介导分别将含报道基因LacZ复制子载体pCMV-rep-LacZ和两个普通表达载体pLNCX-LacZ、pIRES-neo-LacZ转染293细胞;将表达GHRH的复制子载体pCMV-Rep-GHRH和普通载体pIRES-GHRH、pCDNA3-GHRH转染293细胞。分别对不同载体转染细胞表达的β-半乳糖苷酶以及利用RIA 、RT-PCR对表达的GHRH进行了定量分析,结果表明：复制子载体表达外源基因的效率比非复制子载体高2～3倍。本研究为提高外源基因在真核细胞的表达提供了有益的探索。     

H7 亚型禽流感病毒 HA 蛋白在Sf9 中的表达与纯化

【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。     

化橘红花、果中挥发油成分的比较

目的 比较化橘红花、果中挥发油成分差异.方法 采用低温变压浸出法提取化橘红花、果中挥发油,再用精馏法分离、气相色谱-质谱联用技术分析挥发油中轻、重组分.结果 化橘红花、果中轻组分挥发油成分包括萜类、醇类、酯类、脂肪酸和芳香烃类,均以脂肪酸、萜类为主;重组分挥发油成分包括甾醇类、香豆素类、脂肪酸类、萜类和烷烃类,均以甾醇...     

基于多元线性回归的开发井绝对无阻流量预测

对于新钻开发井,气井绝对无阻流量的大小是决定新钻井能否实施的关键指标,所以准确、快捷地预测气井绝对无阻流量对于气藏储量动用、提高采收率具有重要意义.目前绝对无阻流量是通过气井投产后采用稳定试井获得,对于未钻的井现场多数采用类比法,但精度低,影响钻井决策.针对绝对无阻流量预测的问题,首先开展了绝对无阻流量影响因素的渗流理论分析以及与实际生产动态特征的相关性分析,以此为基础,利用多元线性回归方法开展了绝对无阻流量与各地质参数的定量关系研究,建立了新钻开发井绝对无阻流量与不同参数的预测模型,并对不同模型进行了统计学检验以及实例检验.结果表明,影响绝对无阻流量的主要因素主要有地层系数(kh)、地层压力(pe)、孔隙度(φ)、动态储量等,各因变量之间不存在共线性,建立的4种模型中以kh、pe两个参数建立的预测模型在对新钻开发井的实际预测中精度较高,预测模型中需要的参数kh、pe在现场生产中也容易获得,计算方法简单快捷,解决了新钻开发井快速预测问题,为新钻开发井是否实施提供了依据,因此,该方法对气藏打开发井、特别是低渗透气藏后期补打开发井的决策中具有一定的实践意义.