国外生猪育种体系简析及对我国生猪育种的几点思考

选择是生猪育种的核心,而准确地选择和选种依赖于完善和成熟的育种体系。国际养猪发达国家(国际育种企业)对育种体系不断完善,长期进行生长、繁殖和肉品质等各类性状的表型测定,运用多场联合评估和基因组选择等方法不断提高遗传评估的准确性,不断挖掘新的育种性状,并进行测定、评估和选育,实现了种猪群体持续的遗传改良和综合性能的不断提升。本文对欧美发达国家(国际育种企业)的生猪育种技术体系进行了综述,以期为我国的生猪育种工作提供参考,并促进我国生猪种业的创新发展。     

交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定

鸭甲型肝炎（duck hepatitis A,DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,是一种雏鸭的急性、高度致死性传染病。本研究旨在研制一种对我国流行的鸭甲型肝炎血清1型（DHAV-1）和血清3型（DHAV-3）病毒具有交叉中和作用的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。人工合成12条DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白共有的抗原表位肽,分别与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）载体偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb。通过检测McAb与DHAV-1和DHAV-3的交叉反应性,测定McAb对病毒增殖的抑制效率、中和效价以及攻毒保护率等来筛选McAb。本研究共获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,其中6株（C1、C4、C7、C12、C13、C16）分泌的McAb同时与DHAV-1和DHAV-3发生特异性交叉反应; C1、C4、C7、C16可以抑制DHAV-1和DHAV-3在鸭胚中的增殖,抑制率在75.34%～100.00%不等;对DHAV-1和DHAV-3的中和效价：C1（1：3&1：5）、C4（1：3&1：3）、C7（1：10&1：11）和C16（1：9&1：9）;C7和C16对DHAV-1和DHAV-3攻毒雏鸭的保护率较高,分别为“70%、80%”和“100%、60%”。本研究成功研制出对DHAV-1和DHAV-3具有交叉中和活性的McAb 4株,其中2株对病毒的感染具有良好的预防效果,为DHA的防控提供了新材料和新思路。     

microRNA-146a通过靶向MAPK4和Myosin Va基因调控羊驼黑色素细胞增殖、迁移

旨在研究microRNA-146a(miR-146a)对羊驼黑色素细胞增殖和迁移的调控及其分子机制。本研究使用双荧光素酶试验验证MAPK4和Myosin Va是miR-146a的靶基因;利用荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹试验检测在羊驼黑色素细胞中过表达miR-146a对相关下游基因表达的影响;利用CCK8和Transwell检测miR-146a过表达对羊驼黑色素细胞增殖和迁移的影响。结果显示,与对照组相比,将miR-146a和MAPK4或Myosin Va共转染293T细胞,双荧光素酶活性分别极显著下降36%和30%(P<0.001);MAPK4和Myosin Va基因转录水平分别极显著下调67%和47%(P<0.001,P<0.01);蛋白质水平的表达量分别显著或极显著下调38%和69%(P<0.05,P<0.01);增殖和迁移相关的基因CREB、MITF、MLPH和Rab27a在转录水平和蛋白水平的表达均极显著下调(P<0.01,P<0.001);CCK8和Transwell结果显示,过表达miR-146a使羊驼黑色素细胞的增殖和迁移能力极显著下调(P<0.01)。综上所述,miR-146a通过靶向调控MAPK4和Myosin Va,使增殖和迁移相关的基因MEK1、CREB、MITF、MLPH和Rab27a的表达下调,从而对羊驼黑色素细胞的增殖和迁移起抑制作用。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10¹~3.31×10⁷拷贝·μL^-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R²）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10¹拷贝·μL^-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^6.7、10^5.3拷贝·mL^-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。     

番鸭产蛋各期肝脂肪酸组成及AMPK信号通路基因表达研究

旨在探究产蛋各期番鸭肝腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路基因表达和肝脂肪酸组成,为番鸭肝脂质代谢应答产蛋提供机理研究。本研究选取开产前22周龄、产蛋初期30周龄、产蛋中期40周龄和产蛋末期60周龄母番鸭各15羽,全自动生化仪测定血脂水平,苏木精-伊红（HE）染色和油红O染色观察肝组织学结构,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）检测肝AMPK通路基因表达,气相色谱-质谱联用法（GC-MS）检测产蛋各期肝脂肪酸组成。结果表明,总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）水平在40周龄显著高于22、30和60周龄（P<0.05）;高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平在30和40周龄显著低于22和60周龄（P<0.05）。肝HE和油红O染色切片显示,肝在22周龄呈实质状,至产蛋40和60周龄,肝脂滴沉积明显（P<0.05）。AMPKα1在22、30、40和60周龄呈本底低水平表达,并显著低于产蛋各期肉碱脂酰转移酶1（CPT1）和脂肪酸合成酶（FAS）的表达量（P<0.05）,FAS在22、40和60周龄均呈高水平表达（P<0.05）;羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）、肝细胞核因子4α（HNF4α）、乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）和固醇调控元件结合蛋白-1（SREBP1c）在40周龄表达量显著高于22和30周龄（P<0.05）。肝中饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1和C20∶2 n-6构成,分别占总脂肪酸含量的32%、16%、30%和9%。C14∶0和C16∶0含量在40周龄显著高于22周龄（P<0.05）;C24∶0、C20∶2 n-6和PUFA含量在60周龄显著高于22和40周龄（P<0.05）。综上,番鸭产蛋期肝通过上调FAS等脂质合成基因表达,合成大量长链脂肪酸,沉积于肝,并增加血脂水平。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

长白和大白猪主要生长性状的遗传参数估计

旨在分析母猪的出生年份、出生季节、初生重、开测日龄等固定效应对长白、大白猪主要生长性状的影响,并对目标生长性状进行遗传参数估计（遗传力、遗传方差、表型相关和遗传相关）,为猪的遗传改良提供基本依据。本试验利用GLM模型分析试验猪群（398头长白猪和1 176头大白猪）的固定效应对猪生长性状的影响,并采用多性状动物模型对目标性状进行遗传参数估计。目标生长性状包括达100 kg体重日龄（age to 100 kg,AGE）、达100 kg背膘厚（backfat to 100 kg,BF）、100 kg平均日增重（average daily gain to 100 kg,ADG）。研究表明,在大白和长白猪中,猪的出生年、出生季、初生重以及开测日龄对生长性状均具有极显著的影响（P<0.001）;长白猪的AGE、ADG和BF的遗传力分别为0.321、0.327和0.324,大白猪对应性状的遗传力分别为0.454、0.469和0.408;长白猪的ADG和AGE之间的遗传相关、表型相关分别为-0.990、-0.995,大白猪的ADG和AGE之间的遗传相关、表型相关分别为-0.993、-0.998,均呈现较强的负相关。长白、大白猪的生长性状（AGE、ADG、BF）均属于中等遗传力性状,其出生年份、出生季节、初生重和开测日龄对猪的生长性状影响较大。在遗传参数估计分析时,提高样本数量并提升表型数据质量,可以增加遗传参数估计的可靠性。本研究中的生长性状遗传参数估计结果较为可靠,可为后续的遗传改良提供参考。     

一种适用于单胎动物多品种选择的基因组关系矩阵

旨在提出一种新型基因组关系矩阵并验证其在多品种联合群体中的模拟应用效果。本研究利用QMsim软件模拟牛的表型数据和基因型数据;利用Gmatrix软件构建常规G阵;利用R语言构建新型G阵,新型G阵在常规G阵的基础上,将多品种联合群体的非哈代-温伯格平衡位点考虑在内;利用DMU软件使用“一步”法模型计算基因组估计育种值（estimated genomic breeding value,GEBV）;比较不同情况下使用两种G阵的GEBV预测准确性。结果表明,在不同遗传力及QTL数下,不对新型G阵使用A₂₂阵加权就能达到常规G阵使用A₂₂阵加权时的GEBV预测准确性。在系谱部分缺失时,新型G阵不加权较常规G阵加权时GEBV预测准确性高。证明,在系谱有部分缺失时,新型G阵对多品种GEBV的预测有一定优势。     

Fas对镉激活PC12细胞线粒体凋亡通路的影响

旨在探究死亡受体Fas在镉致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）凋亡中的作用及其对线粒体通路的调控机制,用10 μmol·L^-1镉处理Fas基因沉默的PC12细胞株12 h,通过Western blot检测BH3相互作用域死亡激动剂（BID）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的活化情况,Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、凋亡诱导因子（AIF）、核酸内切酶G（Endo G）的表达情况,以及细胞色素C（Cyt C）在细胞内的分布情况,免疫荧光染色检测AIF核转位。结果显示,镉极显著上调tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值,诱导Cyt C从线粒体释放到细胞质,激活caspase-9、caspase-3和PARP,增加AIF和Endo G蛋白表达水平（P<0.01）,并诱导AIF核转位;沉默Fas极显著抑制镉引起的tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值升高,Cyt C从线粒体释放到胞浆,caspase-3、PARP蛋白活化和AIF、Endo G蛋白表达水平极显著升高（P<0.01）,显著抑制镉激活的caspase-9（P<0.05）,并抑制AIF核转位。综上表明,Fas通过调控线粒体通路参与镉致PC12细胞凋亡。     

犬慢性肾衰竭进程中肠道菌群代谢物短链脂肪酸水平的变化及其对肾功能的影响

本研究旨在评估短链脂肪酸在慢性肾衰竭患犬和健康犬中的水平,探究短链脂肪酸变化的原因及其对肾功能的影响。选取22例轻度慢性肾衰患犬（M-CRF组）、29例重度慢性肾衰患犬（S-CRF组）和26例健康对照犬（HC组）,用16S rDNA测序技术分析肠道菌群多样性,气相色谱法检测粪中短链脂肪酸浓度。通过粪菌移植和补充丁酸钠给5/6肾摘除犬,观察肠道菌群及丁酸钠对肾功能影响。结果显示：1）S-CRF组肠道菌群多样性指标观察物种数及Simpson指数低于HC组（P<0.05）,PCoA分析显示,S-CRF组肠道菌群与M-CRF、HC组有差异。2）LEfSe分析显示,S-CRF组和HC组间大量差异菌群,拟杆菌科、拟杆菌属及假单胞菌科等7个菌种富集于S-CRF组,普氏杆菌科、梭菌科、普氏杆菌属及普拉梭菌属等11个菌种富集于HC组。CCA分析发现富集于S-CRF组菌种丰度与肾功能指标呈正相关。3）S-CRF组粪中乙酸、丙酸及丁酸浓度均显著低于HC组和M-CRF组,M-CRF组丁酸浓度显著低于HC组（P<0.05）,且丁酸浓度与血中胱抑素C（Cys-c）、肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）等肾功能指标呈负相关（r值分别为-0.451、-0.583和-0.514,P<0.01）。4）与慢性肾衰模型组（5/6 Nx组）比较,慢性肾衰犬给与丁酸钠8周后,血清Cr和BUN显著降低（P<0.05）;粪菌移植8周后,血清Cr和BUN显著升高（P<0.05）,丁酸钠可回调血清Cr和BUN水平。综上表明,慢性肾衰竭患犬肠道菌群多样性降低,菌群结构及丰度改变,粪中短链脂肪酸浓度降低,这些变化可加剧肾功能障碍。为犬慢性肾衰竭的防治提供新的理论依据。