广西巴马小型猪miR-148b慢病毒制备及靶基因通路预测分析

[目的]构建广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示miR-148b的作用机制打下基础.[方法]以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增miR-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上,构建获得pLV-miR-148b慢病毒表达载体;以pLV-miR-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相关通路.[结果]广西巴马小型猪miR-148b片段大小为385 bp,与miRBase 21.0网站上已发布猪miR-148b成熟序列(前体和侧翼序列)的同源性达100%.构建获得的pLV-miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组(P<0.01).数据库预测分析得到18个广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,分别为CLOCK(时间昼夜调控因子)、MIER1(转录调控因子)、MECP2(甲基化CpG结合蛋白)、ZNF704(锌指蛋白)、SPTY2D1(SPT2染色质蛋白)、QKI(RNA结合蛋白)、ZBTB20(锌指蛋白)、MGAT4A(钠/磷酸转运蛋白)、UHMK1(编码蛋白激酶)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶2α肽)、C6orf62(6号染色体开放阅读框62抗体)、HECW2(E3泛素蛋白连接酶)、MAP1B(微管相关蛋白)、NHS(NHS肌动蛋白调节因子)、B4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶)、ATP2A2(肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶)、AP4E1(蛋白复合物接头分子)和BBX(锌指蛋白);且发现有11条靶基因相关通路,其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路.[结论]广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,miR-148b存在18个靶基因和11条相关通路,且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用.     

基于WSN的便携式FPGA农田环境监测系统

针对农田环境信息获取时存在的信息对象多、地域广、分布杂散、数据通讯条件落后等诸多不利因素,设计了采用基于无线传感器网络技术和可编程片上系统(SOPC)技术的便携式农田环境监测系统.该系统通过温度、湿度、光照度等传感器实时采集农田环境数据;以CC2430模块为终端测量节点的核心,建立无线传感器网络实现监测数据的无线传输和汇集:采用具有NiosⅡ嵌入式软核处理器的现场可编程门阵列(FPGA)控制系统实现对整个系统的管理.田间试验结果表明该系统能够有效地采集环境数据,并具有组网灵活、可扩展性强、携带方便等优点.     

复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理

为了研究复合生物保鲜剂对冷藏带鱼优势腐败菌(腐败希瓦氏菌)的抑菌作用机理,通过牛津杯法测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并测定了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌活力、细菌生长曲线、细胞膜完整性和细胞的稳定性,对细菌超微结构进行了观察。结果显示:复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的MIC与MBC分别为1.6 mg/ml与3.3 mg/ml,且随着作用时间的延长,复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的生长有明显抑制作用;尤其经2倍最小杀菌浓度的复合生物保鲜剂处理后,细菌未出现对数生长期;菌液在260 nm处的吸光值明显升高,菌体细胞膜完整性受到破坏;菌体细胞中的碱性磷酸酶升高,菌体细胞壁通透性增大;菌悬液的电导率值明显增大,细胞膜稳定性受损。细菌超微结构观察发现,复合生物保鲜剂作用于菌体细胞后,菌体细胞开始出现皱缩、扭曲变形、表面粗糙和布满泡状物及细胞壁塌陷等现象。表明复合生物保鲜剂可以破坏细菌的细胞内环境和细胞膜稳定性,影响了细菌的正常生长;并且通过影响细菌对营养物质的吸收和代谢物的排出,最终导致菌体死亡。     

菜用紫云英品种嫩梢产量、营养品质及卫生质量分析

为评价紫云英嫩梢菜用价值,开展紫云英品种田间试验以及产量品质、卫生质量分析。结果表明,菜用紫云英品种嫩梢产量表现为:中花型>早花偏迟>早花型,产量与品种现蕾期、初花期、株高、径粗等均呈极显著正相关,相关度为鲜草产量>初花期>株高>径粗>现蕾期;紫云英嫩梢维生素C、Cu、Mn比豌豆苗、绿豆芽、空心菜高,尤其是维生素C含量高达61.7mg.hg-1,有毒有害物质含量均符合国家标准,食用卫生安全,可作为特色蔬菜利用。     

广西三黄鸡脂蛋白脂酶基因的克隆及蛋白构象分析

【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加（AA）鸡的脂蛋白脂酶基因（LPL）进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡“也基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列（CDs）,大小均为1473bp,两者的同源性为99．4％;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基^503T→C导致氨基酸^168Val→Ala,^606T→G导致^202Asp→Glu,^1066A→G导致^366Thr→Ala,^1277C→T导致^426Ser→Phe,^1420A→G导致^474Arp→Gly,^1432G→A导致^202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。     

狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建

从狂犬病病毒CVS毒株致死的小鼠脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得G基因;以pMD18-T-α质粒为模板,PCR扩增得到IFN-α基因.两个基因和pIRES真核表达载体分别双酶切,连接构建P IRES-G/IFN-α,经PCR、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功.测得的G基因序列长1 575 bp,与CVS株G基因氨基酸同源性为98.5%;IFN-α序列长为570 bp,与GenBank中登录号为NM 001017411的IFN-α基因氨基酸同源性为91.6%.     

入侵植物黄花草木樨的生殖构件性状及种子萌发特性研究

黄花草木樨是广泛分布于我国的一种外来入侵植物,对被入侵地的生物多样性造成严重威胁。通过样方调查和种子萌发实验,对黄花草木樨的生殖构件特性和种子休眠萌发特性进行研究,并探讨其繁殖能力。结果表明,密度对黄花草木樨各生殖构件性状影响各不相同,单枝种子量、总种子量和百粒重与密度成反比,而分枝数在中密度下达到最大,高密度和低密度的株高和分枝数均比中密度下的小;在生殖构件性状相关性方面,总种子量与单枝种子量(r=0.946)呈极显著正相关,百粒重与单枝种子量(r=0.178)呈显著正相关;在萌发特性方面,冷藏对黄花草木樨种子的萌发有促进作用,萌发率提高了约10%,而冷冻对黄花草木樨种子的萌发有抑制作用,萌发率降低约30%;在常温条件下,黄花草木樨种子休眠特性表现为前7个月波动变化很大,7～20个月之间变化基本平稳,萌发率保持80%左右,之后开始逐渐下降,5年后下降至10%以下。研究表明,黄花草木樨具有较高的种子产量和持久的高萌发率,有利于其种群的扩散和定殖。     

贵州碾茶茶园覆网方式浅析

贵州碾茶茶园覆网方式主要有直接覆盖、隧道式覆盖和大棚覆盖3种,其中直接覆盖成本最低,用工最少,操作简单,但容易使蓬面芽叶受损或被灼伤,芽叶产量相对偏低且品质有所下降;大棚覆盖成本最高,用工最多,操作复杂,但蓬面芽叶较完整,受损小,产量较高,芽叶品质有所提高;隧道式覆盖一次性投入比大棚覆盖少,但实际操作时用工较多,芽叶品...     

橡胶树叶片转化酶提取方法的比较

比较液氮研磨样品与蛋白抽提液研磨样品对6种提取橡胶树叶片转化酶方法的效果。结果表明：液氮研磨法对转化酶活性影响很大，特别是中性/碱性转化酶和细胞壁结合的酸性转化酶已基本失活，而可溶性酸性转化酶活性丧失也比较严重。利用蛋白抽提液研磨样品，用Hepes-NaOH法提取的可溶性转化酶的酶活性最高，达472.44 μmol（glucose）/[g（FW）·h]； 虽然磷酸-柠檬酸法获得的粗酶液的蛋白含量较低， 但其酶活性高达441.61 μmol（glucose）/[g（FW）·h]； Tris-HCl法提取的细胞壁结合酸性转化酶的酶活性最高， 达35.83 μmol（glucose）/[g（FW）·h]。从转化酶的比活力看，磷酸-柠檬酸法最佳，所提取的可溶性转化酶比活力约为Hepes-NaOH法的4倍。本研究结果为进一步完善橡胶树叶片转化酶的提取方法提供重要的指导意义。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及对小鼠胚胎稳定性的影响

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）对小鼠胚胎稳定性的影响,运用大肠杆菌表达系统制备了具有生物活性的重组大肠杆菌LT,用重组LT通过腹腔注射处理妊娠小鼠,分析了LT对小鼠胚胎稳定性的影响。首先采用PCR方法从产毒大肠杆菌菌株44815基因组中扩增LT的A、B亚基基因,将其插入到pET-20b（＋）原核表达载体pelB信号肽的下游,分别构建成LTA和LTB分泌型表达载体;将载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG的诱导下进行表达,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶从细菌周质释放液中提取和纯化重组LTA和LTB蛋白;利用细胞毒性试验检测重组蛋白的生物活性。然后用制备的重组LT注射妊娠6d的小鼠,连续注射3d后,统计小鼠的胚胎存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清中与胚胎稳定性密切相关的Th1型细胞因子（IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）及IL-β的表达水平。结果表明,采用分泌性表达策略实现了重组LT在大肠杆菌中的高效分泌表达,LTA和LTB的表达量分别达68、62mg/L。表达的重组LT具有明显的细胞毒性作用;用LT处理妊娠小鼠,胚胎的存活率为32%,明显低于对照组;小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的含量明显高于对照组（P〈0.01）,分别为对照组的2、3倍。同时细胞因子IL-1β为对照组的2倍（P〈0.01）,而稳定胚胎发育的Th2型细胞因子IL-4、IL-10没有明显变化（P〉0.05）。据此推测,LT可能与大肠杆菌性肠炎引起妊娠家畜流产有关,LT对胚胎稳定性的影响除与LT的直接毒性有关外,可能还与LT介导的免疫调节异常有关。