LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是长达200个以上核苷酸的转录本,在不同组织和发育阶段的表达具有特异性。为筛选与猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)致小鼠神经系统损失相关的LncRNA,本试验对正常小鼠和PHEV感染小鼠大脑皮质进行高通量测序,获得PHEV感染过程中LncRNA差异表达数据。经过生物学分析,发现与PHEV感染相关的LncRNA-NONMMUT131476.1位于小鼠第8号染色体Herpud1(homocysteine-inducible,endoplasmic reticulum stress-inducible,ubiquitin-like domain member 1)和Nlrc5(NLR family,CARD domain containing 5)两基因间,由5个外显子构成。利用qPCR方法对感染PHEV的小鼠脑组织和N2a细胞中LncRNA-NONMMUT131476.1及Nlrc5基因的表达量进行检测,发现LncRNA-NONMMUT131476.1和Nlrc5基因的表达量均呈上调。研究发现干扰LncRNA-NONMMUT131476.1后Nlrc5表达被抑制,表明Nlrc5可能为其潜在靶基因。同时,沉默LncRNA-NONMMUT131476.1表达能促进病毒复制增殖,表明该LncRNA可能作为调节因子,参与调控PHEV感染过程,但其具体机制有待于进一步研究。本试验为PHEV感染发病机制和PHEV防制研究提供新思路。     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒J亚群

将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。     

鸡传染性脑脊髓炎的诊断

1999年7月,牡丹江市郊区兴隆镇的2户养鸡户饲养的褐壳新罗曼蛋鸡雏5 000只,在2～3日龄发生了以共济运动失调和头颈部震颤为主要特征的传染病.先后用氯霉素、庆大霉素、恩诺杀星、环丙杀星等药物治疗,均未见效,发病高峰为12～14日龄,发病率为57%,到3周末时死亡率为48%.     

H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

活猪携带猪瘟病毒检测方法比较

对2个猪场的母猪血清、扁桃体、全血样品和公猪精液分别应用荧光抗体染色法、RT-PCR、CS-FV抗原ELISA、CSFV糖蛋白Erns ELISA 4种方法进行CSFV对应检测和比较。结果显示,荧光抗体染色法检出率最高,但与其他3种方法存在较大差异,RT-PCR方法检出率和重复性次之;猪瘟抗原ELISA方法检出率第3,重复性第1;CSFV糖蛋白Erns检出率和重复性均最低,但可筛选是否感染猪瘟病毒野毒。在母猪3种样品中扁桃体的检出率最高,全血样品次之,血清检出率最低。4种样品中公猪精液重复性最好,其次是母猪全血样品,母猪扁桃体第3;母猪血清样品最差。     

牛病毒胜腹泻病的研究进展

牛病毒性腹泻.粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种呈多种临床症状的疾病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失.本文从BVD的病原学、发病机理、诊断、治疗和预防等方面进行了详细阐述.     

环境高温对两品种肉鸡生长、胴体性状及脂肪沉积的影响

选择体重相近、健康的5周龄AA肉鸡公鸡和北京油鸡公鸡各108只,评价持续高温对其生产性能、胴体组成、脂肪沉积的影响,比较其对高温耐受性的差异。试验设3个处理：34℃持续高温,自由采食（试验组,34AL）;21℃适温,自由采食（适温对照组,21AL）;21℃适温,采食量与34AL组相同（采食配对组,21PF）。所有仔鸡在人工环控舱饲养至8周龄试验结束。结果表明：AA肉鸡在持续高温下的采食量比适温对照组降低45%（P〈0.001）,日增重由61.45 g/d降至22.29 g/d（P〈0.001）,饲料利用率明显降低（P〈0.05）。对北京油鸡而言,热暴露虽然也使采食量大幅下降（下降幅度为20%,P〈0.001）,但日增重却没有受到高温的影响,饲料利用率明显提高（P〈0.05）。北京油鸡在试验期间无一死亡,而高温处理的AA肉鸡死亡率高达36%。与适温对照组相比,高温试验组AA肉鸡的胸肌率明显下降（P〈0.05）,肌间脂肪和皮下脂肪的沉积率明显降低（P〈0.01）,腹脂沉积率无明显变化（P〉0.05）。北京油鸡胸肌率未受到高温的影响,但热暴露北京油鸡腹脂沉积率明显高于适温对照组（P〈0.05）,肌间脂肪和皮下脂肪的沉积相对稳定（P〉0.05）。研究表明,北京油鸡对高温表现出极高的耐受性,在持续34℃高温下正常的生长、发育没有受到影响;AA肉鸡在持续34℃高温下,正常的生长、发育被极大程度地破坏,死亡率高。北京油鸡适应高温的调节机制可能与其在高温下腹脂沉积增加及饲料利用率提高有关。     

日粮蛋白质水平对多阶段周龄饲养肉鸡生产性能、胴体组成及氮排出的影响

试验选用768只1日龄肉公鸡,随机将其分为6个处理,每个处理8个重复。依据理想赖氨酸:蛋氨酸比例及赖氨酸需要量回归方程,研究每周赖氨酸需要量分别增加5%、10%以及降低5%、10%、15%后,日粮中不同蛋白质水平对肉鸡生产性能、胴体组成及氮排出的影响。试验结果表明:①氨基酸-蛋白质水平提高后可显著降低0～7周龄肉鸡腹脂含量(P0.05),对生产性能及胸肉、腿肉产量无显著影响;②降低氨基酸-蛋白质水平能显著降低粪氮排出(P0.05),当氨基酸水平降低10%～15%后,肉鸡腹脂量显著增加(P0.05),对0～7周龄肉鸡平均体重、体增重、采食量、饲料转化率及胸肉、腿肉产量没有显著影响(P0.05);③0～1周龄肉公鸡日粮中赖氨酸水平降低5%(蛋白水平降为21.47%)时,对其生产性能和胴体组成无任何不良影响,同时可最大程度地减少氮排出。     

The 16MΔvjbR as an ideal live attenuated vaccine candidate for differentiation between Brucella vaccination and infection

Brucellosis brings great economic burdens for developing countries. Live attenuated vaccines are the most efficient means for prevention and control of animal Brucellosis. However, the difficulties of differentiating of infection from vaccine immunization, which is essential for eradication programs, limit their applications. Therefore, the development of a vaccine that could differentiate infection from immunization will overcome the limitations and get extensive application. VjbR is a quorum sensing regulator involving in Brucella's intracellular survival. The vjbR∷Tn5 mutants have been proven effective against wild type strain challenge, implying its possibility of use in vaccine candidate development. To further evaluate this candidate gene, in the present study, the antigenicity of purified recombinant VjbR protein was analyzed. Antibodies to Brucella melitensis VjbR could be detected in sera from patients and animals with brucellosis but not in control ones, implying the potential use of this protein as a diagnostic antigen. Then a vjbR mutant of B. melitensis 16M was constructed by replacing the vjbR with kanamycin gene. The mutant showed reduced survival in macrophage and mice. Vaccination of BALB/c mice with 16MΔvjbR conferred significant protective immunity against B. melitensis strain 16M challenges, being equivalent to which induced by the license vaccine Rev.1. The vjbR deletion mutant elicited an anti-Brucella-specific immunoglobulin G response and induced the secretion of gamma interferon and interleukin-10. The most importance is that, the use of vjbR mutants as vaccines in association with diagnostic tests based on the VjbR antigen would allow the serological differentiation between infected and vaccinated animals. These results suggest that 16MΔvjbR is an ideal live attenuated vaccine candidate against B. melitensis and deserves further evaluation for vaccine development.