Mannheimia granulomatis PCR检测方法的建立

Mannheimia granulomatis是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌.为快速、准确诊断由该菌导致的疫病,从基因库中获得M.granulomdtis的基因序列,再从M.granulomatis的基因序列中获得与其他细菌包括溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段,设计引物,建立了特异性好、敏感性较高的M.granulomatis的PCR诊断方法.结果表明,其特异性为100%,最小检出量为5×104cfu/mL～5×103cfu/mL M.granulomatis或1/10个单个菌落.     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25—4株为研究对象，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序，并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E．coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在，包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western—blotting免疫印迹实验，结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

牛至精油和莫能菌素对荷斯坦犊牛瘤胃发酵参数和菌群结构的影响

本试验旨在研究牛至精油和莫能菌素对荷斯坦犊牛瘤胃发酵参数和菌群结构的影响。试验选用了80头新生荷斯坦犊牛,体重(41.31±2.23)kg,随机分为4组,每组20头。牛至精油组开食料中添加4.0 g/kg牛至精油,莫能菌素组开食料中添加3.6 g/kg莫能菌素,混合组开食料中添加4.0 g/kg牛至精油+3.6 g/kg莫能菌素,对照组开食料中不添加任何饲料添加剂。饲喂70 d后,从每组中选取体重相近的试验牛3头,采集12头犊牛的瘤胃液,检测瘤胃发酵参数,并运用高通量测序方法测定瘤胃菌群结构及多样性。结果表明:1)莫能菌素组和混合组的瘤胃液氨态氮含量显著低于对照组(P<0.05);莫能菌素组的瘤胃液丙酸比例显著高于对照组(P<0.05)。2)门水平上,牛至精油组、莫能菌素组、混合组的瘤胃液中变形菌门的相对丰度极显著低于对照组(P<0.01);莫能菌素组的瘤胃液中拟杆菌门的相对丰度有高于对照组的趋势(0.05≤P<0.10)。3)属水平上,牛至精油组、莫能菌素组和混合组的瘤胃液中普雷沃氏菌属的相对丰度有高于对照组的趋势(0.05≤P<0.10);牛至精油组的瘤胃液中丁酸弧菌属的相对丰度有低于对照组的趋势(0.05≤P<0.10);莫能菌素组的瘤胃液中奥尔森菌属的相对丰度显著低于对照组(P<0.05),瘤胃球菌属和丁酸弧菌属的相对丰度均有低于对照组的趋势(0.05≤P<0.10);混合组的瘤胃液中梭菌属的相对丰度有低于对照组的趋势(0.05≤P<0.10)。综上所述,饲粮中添加牛至精油可以调节瘤胃微生物的菌群结构,提高犊牛瘤胃中蛋白质降解菌的相对丰度,降低产丁酸菌属的相对丰度,同时可能避免或者缓冲莫能菌素对有益菌群的破坏。     

从江香猪生精上皮周期及睾丸发育的形态学分析

试验旨在探究初情期前后生精上皮周期差异及睾丸发育过程中的形态学变化。通过测定15、30、60和90 d睾丸相关指数,结合睾丸组织形态学特征,判断香猪初情期,划分从江香猪生精上皮周期。结果显示,30 d的睾丸指数较15 d极显著升高（P<0.01）,睾丸重、长轴及短轴的增长率分别为298.05%、66.42%和65.45%,60和90 d两个阶段睾丸重增长率相对稳定。形态学观察表明,从江香猪30 d时生精小管出现游离精子,完成第一次生精并进入初情期;与15 d相比,30 d生精小管面积和生精上皮厚度极显著增加（P<0.01）,增长率分别为136.12%和40.19%,在60和90 d均处于稳定增长状态。睾丸细胞数统计显示,日龄增加不影响支持细胞（setoli cells,SC）数量（P>0.05）,而30 d生殖细胞数（germ cells,GC）较15 d极显著增加（P<0.01）。相关分析结果发现,生殖细胞数量增加与生精小管面积增大、生精上皮厚度变化之间呈明显正相关（r=0.994;0.96）。根据生殖细胞组合形式差异,将初情期前后生精上皮分为3和8个阶段。初情期前生殖细胞以第一次减数分裂前期为主,A、B型精原细胞、SC、初级精母细胞（primary spermatocyte,Ps）、前细线期（preleptotene,PI）、细线期（leptotene,L）等生殖细胞在初情期前后生精上皮中均存在,而圆形精子（round spermatids,R）、延伸精子（elongating spermatid,E）、精子细胞（spermatozoa,S）仅存在于初情期后的生精上皮。本研究结果表明,从江香猪30 d初情,睾丸发育以生殖细胞和生精小管面积的迅速增加为主,该结果对从江香猪早熟性状挖掘、种猪选育及开发利用等有重要的指导意义。     

饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对荷斯坦犊牛血清生化指标、消化酶活性及瘤胃微生物区系的影响

旨在研究牛至精油（oregano essential oil,OEO）与莫能菌素（monensin,MON）对荷斯坦犊牛血清生化指标、消化酶活性以及瘤胃微生物区系的影响。本试验前期阶段选用了体重相近（（41.31±2.23）kg）,体况良好的荷斯坦初生犊牛80头,随机分为4组,每组20头,采用单栏饲养。对照组饲喂全脂牛乳和颗粒饲料,其他3个试验组在饲喂全脂牛乳和颗粒饲料的基础上分别添加4 g·kg^-1牛至精油、3.6 g·kg^-1莫能菌素和7.6 g·kg^-1牛至精油和莫能菌素的混合物,饲喂至56、70日龄时,从每组中选取6头体重相近的公犊,颈静脉采血测定血清指标,并通过口腔导管的形式采集犊牛的瘤胃液,检测消化酶活性以及瘤胃微生物区系。结果表明：1）添加牛至精油显著提高了56日龄犊牛血清中TP、SOD、GSH和GSH-Px的浓度（P ≤ 0.05）;莫能菌素对56、70日龄犊牛BUN浓度有降低的趋势（P<0.10）。2）牛至精油显著降低了56、70日龄犊牛瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌的数量（P<0.05）,显著提高了白色瘤胃球菌的数量（P ≤ 0.05）;莫能菌素显著降低了56、70日龄犊牛瘤胃中原虫的数量（P ≤ 0.05）,并有降低白色瘤胃球菌数量的趋势（P<0.10）,在56日龄时,莫能菌素有降低犊牛瘤胃中黄色瘤胃球菌数量的趋势（P<0.10）;牛至精油和莫能菌素对56、70日龄犊牛瘤胃中溶纤维丁酸弧菌有显著的交互作用（P ≤ 0.05）;在56日龄时,牛至精油和莫能菌素对栖瘤胃普雷沃氏菌有交互作用的趋势（P<0.10）,而在70日龄时则呈显著的交互作用（P ≤ 0.05）。3）牛至精油和莫能菌素对56、70日龄犊牛瘤胃中胃蛋白酶浓度有显著的交互作用（P ≤ 0.05）。综上所述,饲粮中添加牛至精油可提高犊牛的免疫力和抗氧化能力。莫能菌素在抑制瘤胃内原虫数量上强于牛至精油,牛至精油对提高主要蛋白质降解菌数量的作用效果优于莫能菌素。总之,牛至精油可改善犊牛的健康状况以及调控瘤胃微生物区系,牛至精油作为天然植物抗生素可替代犊牛期预防性治疗的其他类抗生素生长促进剂。     

不同水平的植物乳杆菌代谢产物对肉鸡生长性能、粪微生物菌群及绒毛形态的影响

本试验在日粮中添加不同水平的植物乳杆菌代谢产物,研究其对肉鸡生长性能、粪微生物菌群、挥发性脂肪酸含量及小肠绒毛形态的影响。选择健康、体重一致的1日龄AA肉鸡576只,采用单因素试验设计,随机分为6组,每组4个重复,每个重复24只鸡,对照组饲喂基础日粮+80 mg/kg新霉素,处理组分别在基础日粮中添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4和0.5%不同水平的植物乳杆菌代谢产物。试验共进行42 d。结果显示:0.4%植物乳杆菌代谢产物组较对照组、0.1%、0.3%和0.5%植物乳杆菌代谢产物组显著提高了42 d肉鸡末重、总增重和平均日增重(P <0.05),0.1%和0.3%植物乳杆菌代谢产物组较0.4%植物乳杆菌代谢产物组显著提高了肉鸡饲料转化率(P <0.05)。对照组较各植物乳杆菌代谢产物组显著提高了粪中大肠杆菌含量(P <0.05),与0.4%植物乳杆菌代谢产物组相比,对照组、0.1%、0.2%和0.5植物乳杆菌代谢产物组显著降低了粪中乙酸含量(P <0.05),0.1%植物乳杆菌代谢产物组较0.3%、0.4%和0.5%植物乳杆菌代谢产物组显著提高了粪中丁酸含量(P <0.05)。0.4%植物乳杆菌代谢产物组总挥发性脂肪酸含量最高,显著高于对照组(P <0.05)。0.4%植物乳杆菌代谢产物组十二指肠和空肠绒毛高度显著高于其他各组(P <0.05),0.2%和0.3%植物乳杆菌代谢产物组十二指肠绒毛高度显著高于对照组、0.1%和0.5%植物乳杆菌代谢产物组(P <0.05),0.2%植物乳杆菌代谢产物组空肠绒毛高度显著高于对照组、0.1%和0.5%植物乳杆菌代谢产物组(P <0.05)。0.1%植物乳杆菌代谢产物组回肠绒毛高度最高(P <0.05)。对照组和0.1%组植物乳杆菌代谢产物十二指肠和空肠隐窝深度显著高于0.4%和0.5%植物乳杆菌代谢产物组(P <0.05),但对照组回肠隐窝深度最低(P <0.05)。结论 :日粮添加植物乳杆菌代谢产物可以改善肉鸡生长性能,降低粪中大肠杆菌含量,提高小肠绒毛高度和粪中挥发性脂肪酸含量,其中日粮添加0.2%和0.4%植物乳杆菌代谢产物对肉鸡增重、饲料转化率和绒毛高度的影响最佳。     

湖南省畜禽粪污排放量估算与环境效应

了解湖南省畜禽粪便及其污染物排泄情况,为畜禽养殖业污染物防控与治理提供依据。本论文以《2011湖南农村统计年鉴》中畜禽出栏数作为统计基数,根据畜禽粪便排放系数和粪污含量,估测了2011年湖南省畜禽粪污排泄情况。结果表明,2011年湖南省畜禽粪便产生总量为6680.29万t,COD 327.49万t,BOD 302.39万t,NH₃-N 26.04万t,总磷30.78万t,总氮64.45万t;畜禽粪便中重金属排泄量分别为Zn 3802.54 t,Cu 2772.43 t,Cr 335.67 t,Pb 265.06 t,Cd 51.11 t,Ni 240.60 t,As 47.63 t,Hg 2.16 t;2011年湖南省畜禽粪便发酵生产沼气总量约为572088万m³。畜禽养殖业粪污排泄量巨大,危害之大,应坚持减量化、无害化和资源化三原则,倡导畜牧健康养殖理念。     

体外诱导牛骨髓间充质干细胞向乳腺样上皮细胞分化的初步研究

为培育转基因肉牛提供种子细胞及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的多向分化潜能,本试验利用细胞免疫荧光染色方法和分子生物学方法初步探讨在表皮生长因子、胰岛素、催产素和孕酮等条件下,体外诱导牛BMSC向乳腺样上皮细胞分化的可能性。利用不同浓度的诱导液对纯化稳定的P4、P8和P12代牛BMSC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞免疫荧光观察和RT-PCR鉴定。结果显示,诱导后部分BMSC细胞呈多角形,而不再呈明显的梭形和纺锤形,经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。P4代牛BMSC在诱导液Ⅱ的诱导作用下分化效果显著。RT-PCR结果显示,诱导分化后细胞角蛋白19基因、β-酪蛋白基因及αs1-酪蛋白基因在细胞中表达。因此,在体外,多因子联合诱导可使牛BMSC初步分化为乳腺样上皮细胞并且在诱导液Ⅱ的联合诱导下分化作用最明显。