抗菌肽在畜牧业中的应用前景

抗菌肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽,是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽,也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分.现在发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中,它具有广谱抗菌、抗病毒、杀肿瘤细胞、热稳定、强碱性、易溶于水和带正电荷等特点,相对分子质量低及对真核细胞几乎没有毒不良反应.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)GD株的E蛋白基因,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV vector中,构建腺病毒重组表达载体。经过抗性筛选、PCR扩增、单酶切等方法对其进行鉴定,确定得到了含有目的基因的阳性克隆,成功构建了腺病毒表达载体pAd-E。同时转染293细胞并进行了初步鉴定,进一步的研究还在继续。本研究为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。可侵害各年龄的猪,已成为猪的一种世界性疾病,给养猪业造成巨大经济损失,有效的疫苗接种是目前大多数国家控制本病流行的重要措施。在过去的十年中,人们重点构建基因工程疫苗,但效果不一。灭活苗或弱毒活苗虽然仍显示着良好的优势,但一种安全、有效新型疫苗的研制已成为必然趋势。     

猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24 h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56 d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2 ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28 ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组（P<0.05）。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。     

伪狂犬病病毒gG—gD基因片段的扩增及克隆和序列测定

以伪狂犬病病毒（PRV）HB－9304株的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）对其gG-gD基因片段进行扩增，获得了预定大小的片段，将这一片段克隆到质粒载体pPK中。对重组质粒pPKGD进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定，证实了克隆片段的可靠性。     

猪繁殖与呼吸道综合征RT-PCR诊断方法的建立

根据猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）核衣壳蛋白ＯＲＦ７的序列,设计了１套引物,对立了检测ＰＲＲＳＶ核酸的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对猪繁殖与呼吸道综合征（ＰＲＲＳ）标准毒株的检测,证明该方法不仅能够扩增出特异性的核酸片段。同时可以从基因水平上区分ＰＲＲＳＶ美洲型和欧洲型。使用该方法对国内临床上疑似为ＰＲＲＳ的送检样品进行检测,结果为阳性,并确定基因型均为美洲型。该研究建立的从组织中直接提取细胞总     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员,主要引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染,从而导致新生仔猪发生继发感染,生长发育受阻,有时可出现神经症状,死亡率升高.     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

利用毕赤酵母系统表达O型口蹄疫病毒VP1基因,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。将VP1基因克隆入毕赤酵母分泌性表达载体pPICZα-C中,获得重组表达载体pPICZαC-VP1。将重组质粒pPICZαC-VP1线性化后,用电穿孔法转入酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠,然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明,酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

蝉新型抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的Cryptonin基因片段。基因克隆到pPICZα-C质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-Cryptonin。pPICZα-C-Cryptonin通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,Cryptonin蛋白获得分泌表达,其相对分子质量约为2700。表达产物耐热性强,在100℃条件下10min内抗菌活性不变,煮沸30min以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很好的抑菌活性。