氟虫腈急性致死作用对中华稻蝗种群遗传结构的影响

采用急性毒性实验方法,比较了氟虫腈处理后中华稻蝗多态基因座位(Ldh,Gpi,Pgm,Me)各基因型个体的死亡率差异。从平均每个基因座位的等位基因数(A=3.3)、平均观察杂合度(Ho=0.387￣0.404)和平均期望杂合度(He=0.430￣0.431)三个参数可知,中华稻蝗具有较高的遗传多样性,适合用于对具有不同基因型的个体的致死性差异研究。用氟虫腈农药制剂(0.12μg·g-1)注射中华稻蝗557头,48h后平均死亡率为57%。将存活个体和死亡个体分别进行等位酶分析以确定每个个体的基因型。列联表X2检验结果表明,氟虫腈对Gpi、Pgm和Me各基因型个体的选择呈现随机特征,各基因型与死亡率未见显著相关(P>0.05)。但在Ldh基因座位上,各基因型个体的死亡率分别为49%(Ldh-AA)、58%(Ldh-AB)和54%(Ldh-BB),且Ldh-AA个体与Ldh-AB个体之间的基因型与死亡率存在显著相关(P<0.05)。根据Roger's遗传距离所得的聚类分析,氟虫腈的急性致死作用使中华稻蝗种群的遗传结构产生了一定的分化作用。     

不同中华稻蝗种群对马拉硫磷的敏感性及乙酰胆碱酯酶特性的比较

采用生物测定方法．对采自山西省晋源区和陕西省长安县的中华稻蝗种群对马拉硫磷的敏感性及其乙酰胆碱酯酶（ACHE）进行了研究。结果表明,长安种群比晋源种群对马拉硫磷的敏感性低4．79倍。动力学研究表明,晋源种群的动力学参数米氏常数（Km值）和最大反应速度（Vmax值）均比长安种群的高。体外抑制结果表明,两个种群中华稻蝗对所选用的3种有机磷杀虫剂的敏感性从高到低依次为：氧化毒死蜱〉对氧磷〉甲基内吸磷,且长安种群的双分子速率常数（k值）比晋源种群的低。体外抑制结果与生物测定的结果相一致,但动力学研究结果与生物测定存在差异。由此可见,两种群对马拉硫磷的敏感性差异的原因之一可能是乙酰胆碱酯酶的不敏感性,而与酶活性的升高没有明显相关性。     

飞蝗Argonaute1的分子特性及生物学功能

【目的】MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的非编码RNA,通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能。Argonaute1(AGO1)蛋白作为miRNA沉默复合物(miRNA silencing complex RISC)的重要组成部分,在miRNA调控通路中起着关键作用。论文旨在研究AGO1的生物学功能及其对飞蝗(Locusta moratoria)生长发育的影响,为探索昆虫miRNA的生物合成和农业害虫的有效控制提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法在飞蝗转录组数据库中获得Lm AGO1 c DNA序列;使用在线蛋白翻译软件(Ex PASy)对Lm AGO1进行蛋白翻译,利用SMART分析Lm AGO1蛋白的功能结构域;选取家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等模式昆虫的同源序列与Lm AGO1氨基酸序列进行聚类分析,采用Phyml软件构建昆虫AGO蛋白的系统发育树;为了进一步研究Lm AGO1在飞蝗生长发育过程中的作用,使用T7 RiboMAX~(TM) Express RNAi System体外合成Lm AGO1的ds RNA,在飞蝗4龄第2天和5龄第2天若虫期连续两次注射ds RNA进行干扰,同时注射ds GFP作为对照。分别收集注射ds RNA后48 h和72 h的整虫样品提取RNA,反转录为c DNA。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测Lm AGO1在不同时间点的干扰效率并观察虫体的发育表型。同时,为了检测Lm AGO1沉默是否会影响miRNA的生物合成,采用RT-q PCR对飞蝗体内5个高丰度miRNA表达进行定量分析。【结果】Lm AGO1蛋白含845个氨基酸,具有典型的AGO蛋白家族保守结构域,即位于213—348位点的PAZ结构域和502—804位点的PIWI结构域。聚类分析表明,Lm AGO1蛋白与其他昆虫的AGO1蛋白聚为一类。通过AGO1氨基酸序列同源比对结果显示Lm AGO1与模式昆虫果蝇、家蚕AGO1的氨基酸序列一致度高达82.2%和86.9%。RNAi结果表明,虫体注射ds Lm AGO1 48 h和72 h后,与对照组相比,Lm AGO1表达量均显著降低,干扰效率分别为88.1%和93.0%;进一步观察试虫生长发育的表型特征,与对照组相比,飞蝗4龄期注射dsL m AGO1后其生长发育并没有出现明显异常,待蜕皮发育至下一龄期(即5龄期)时,出现大量死亡,死亡率为89.3%;荧光定量PCR结果显示注射ds Lm AGO148 h后,飞蝗体内miRNA-252和miRNA-8的表达显著下降,干扰72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表达均显著下降。【结论】飞蝗AGO1除参与RSIC的形成以外,还可能参与miRNA的剪切加工过程进而调控飞蝗的正常发育。     

中华稻蝗（Oxya chinensis）对重金属镉的累积及排泄

为了研究重金属镉（Cd）在植食性昆虫体内的累积和排泄规律,通过Cd慢性染毒的方法,用不同浓度Cd溶液培养的麦苗饲喂中华稻蝗（从4龄若虫至成虫）,采用原子吸收法测定Cd在中华稻蝗（Oxyachinensis）整虫和中肠的蓄积及Cd在其粪便和蜕中的排泄量。研究结果表明,Cd在中华稻蝗整虫和中肠中的累积规律相似,即随着麦苗中Cd含量的增加,整虫和中肠中Cd的累积量明显升高,且各处理间存在显著差异（P〈0.05）。部分Cd可以通过粪便的排泄和蜕皮过程而排出体外。用不同Cd浓度的麦苗饲喂中华稻蝗后,其粪便和蜕中的Cd排泄量与对照组相比显著升高（P〈0.05）,且各处理间差异显著（P〈0.05）。中华稻蝗整虫、中肠、粪便和蜕中的Cd含量与食物（麦苗叶片）中的Cd含量存在显著的剂量-反应关系,其相关系数分别为：整虫0.977、中肠0.920、粪便0.967、蜕0.840。研究结果可为进一步研究Cd在中华稻蝗体内积累和排泄的动态变化规律提供理论和实验依据。     

敌百虫对中华稻蝗磷酸葡萄糖异构酶基因型的致死性差异研究

采用急性致死处理及等位酶电泳分析方法,研究比较了敌百虫处理后中华稻蝗Gpi、Ldh和Pgm各基因型频率在存活组与死亡组之间的差异。结果表明,敌百虫对中华稻蝗3种多态酶基因座位不同的基因型表现出不同的选择性致死作用,其中敌百虫对Ldh和Pgm各基因型的选择呈现随机特征,死亡组和存活组各基因型分布没有显著关联(P>0.05);而敌百虫对Gpi各基因型的选择呈现出非随机效应,在Gpi基因座位上,具有不同基因型个体的死亡率分别为Gpi-AA(47%),Gpi-AB(58%),Gpi-BB(56%)和Gpi-BC(18%)。x2独立性检验表明,Gpi-BC与其他3个基因型在存活组和死亡组之间存在显著关联(P<0.05)。以上结果表明本中华稻蝗种群Gpi-BC基因型很可能与敌百虫的抗药性有关。     

镉长期暴露对中华稻蝗抗氧化机制的影响

采用生长于Cd2+污染条件下的小麦苗喂养中华稻蝗的慢性染毒方法,研究了Cd2+胁迫对中华稻蝗SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度的影响.结果表明,在Cd2+的作用下,中华稻蝗体内SOD、CAT、GPx活性和H2O2浓度均发生变化,表明Cd2+可导致中华稻蝗体内产生ROS.SOD、CAT、GPx 3种酶对Cd2+有一定的耐受性:当Cd2+浓度在这3种酶的耐受范围内,酶活性提高,反之酶活性降低.Cd2+与抗氧化系统间的关系复杂,SOD、CAT、GPx共同承担清除ROS、保护中华稻蝗的重要作用.     

镉急性染毒对中华稻蝗精卵巢小分子热休克蛋白基因表达的影响

小分子热休克蛋白(s HSPs)能够被环境胁迫诱导,采用不同浓度氯化镉(Cd Cl2)溶液对中华稻蝗5龄若虫进行急性染毒,利用Real-time PCR技术对5个小分子热休克蛋白基因Oc HSP19.1、Oc HSP19.8、Oc HSP20.4、Oc HSP20.7和Oc HSP21.1在精巢和卵巢的表达进行了分析。结果表明:在精巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP19.8基因经0.16μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比均显著升高;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,其在2 h表达水平最高,之后显著降低;经0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在2 h和6 h的表达量均高于对照组,在12 h的表达量低于对照组,Oc HSP19.8基因在2 h的表达量高于对照组,在6 h的表达量低于对照组,之后二者表达量都显著升高,在36 h表达量最高,分别为对照组的6.3倍和5.4倍。在卵巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP21.1基因经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比无显著差异;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在6 h和12 h的表达水平高于对照组,但在24 h低于对照组,Oc HSP21.1基因在2、6、12 h和24 h的表达水平与对照组相比均显著降低,但二者都在36 h表达量最高,分别为对照组的4.8倍和4.6倍;经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP20.7基因在2 h表达水平高于对照组,经0.32μg·μL-1Cd2+处理,该基因的表达水平随着时间的延长出现先升高后降低的趋势。Oc HSP21.1基因在精巢内和Oc HSP20.4基因在卵巢内的表达水平与对照组相比无显著差异。研究结果显示,Cd急性诱导中华稻蝗5个Ocs HSPs基因在精巢和卵巢的表达模式不同,其表达量与Cd浓度和作用时间相关。     

飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位

【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2'、R3')进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L~(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2'和R3'蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2'和R3'设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L~(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2'蛋白,可直接用于免疫;而R3'蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好。用多克隆抗体杂交实验室保存的His-LmdsRNase2和His-LmdsRNase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别LmdsRNase2和LmdsRNase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致。采用Western blot方法检测,发现LmdsRNase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,LmdsRNase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达。进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现LmdsRNase2和LmdsRNase3均在中肠细胞质中表达,但LmdsRNae3的表达量较低。【结论】成功制备了特异性良好的飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明LmdsRNase2在中肠细胞质中高表达,而LmdsRNase3的表达量很低。研究结果为飞蝗中肠两个dsRNA降解酶LmdsRNase2和LmdsRNase3的功能分化提供了蛋白水平的证据。     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。