山定子抗褐斑病菌侵染的细胞学研究

为揭示山定子抗褐斑菌机制,运用透射电子显微技术,观察苹果褐斑菌(Diplocarpon mali)侵染不同抗性材料的细胞超微结构变化特点。结果表明,接种3d和5d,山定子细胞核逐渐凝集,叶绿体和线粒体等细胞器逐渐降解,而接种相同时间的‘富士’细胞超微结构变化程度较山定子严重。接种5d,‘富士’病健交界以及距病健交界2cm、4cm的细胞核凝集和细胞器结构畸形程度均比山定子严重,且距发病部位越近则‘富士’和山定子叶片细胞核凝集及线粒体降解程度越严重。表明,接种部位山定子细胞超微结构变化较‘富士’推迟,与发病部位相邻的未发病部位细胞死亡程度较‘富士’轻,推测山定子的抗性可能与细胞超微结构变化的推迟和减弱相关。     

向日葵与锈菌互作过程中活性氧的积累

为了探讨向日葵品种与锈菌互作中活性氧的产生和积累与向日葵抗锈病性的关系,采用分光光度计法及联苯胺蓝(DAB)、氮兰四唑(NBT)染色法对过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子自由基(O2-)诱导积累的过程进行了检测.结果表明:接种后抗、感病品种均出现H2O2和O2-双峰,侵染早期积累明显,最高峰出现在16 h,在抗病品种中活性氧产生和积累明显高于感病品种;在抗病品种中侵染位点活性氧的产生及积累较明显,接种后16h,侵染位点周围的染色范围较大,染色较深,H2O2及O2-的染色比例均达到最高,分别为65.5%和41%;而在感病品种的侵染位点没有检测到明显的活性氧积累.     

条锈菌诱导下的小麦叶片总RNA提取方法的比较及LD-PCR扩增

为寻找一种既能提取到高质量高产量小麦RNA、又能提取到高质量条锈菌RNA的方法,利用Trizol法、Licl法、SDS法和Bizol法分别从条锈菌诱导的小麦叶片中提取了总RNA,并对Trizol法和Bizol法提取的RNA进行了长距离PCR(LD-PCR)扩增.结果表明,Trizol法、Licl法、SDS法和Bizol法提取的RNA产量(μg/100 mg鲜重叶片)分别为4.72、1.15、1.56、10.43 μg/100 mg,Trizol法和Bizol法提取的RNA产量明显高于Licl法和SDS法.Trizol法提取的RNA合成的cDNA片段大小主要集中在0.25～2.0 kb范围内,而Bizol法提取的RNA合成的cDNA片段大小主要集中在0.5～5.0 kb范围内,Bizol法提取的RNA反转录合成的cDNA质量好于Trizol法.Bizol法同样能提取到高质量的条锈菌RNA,而且提取RNA的成本较低.综合各种因素,Bizol法是条锈菌诱导下的小麦叶片总RNA提取的较理想方法.     

条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库构建及表达序列标签分析

 以小麦品种水源11和条锈菌CY31号小种为材料,用SMARTTMcDNA Library Construction Kit构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。得到原始文库的滴度为6×10⁶pfu/mL,扩增文库滴度9×10⁹pfu/mL,重组率98%,插入片段在0.5~2.2kb。随机挑取600个克隆,测序获得594条高质量ESTs,与GenBank序列进行BLASTx分析,已知功能ESTs与植物同源比例最高,占44%;其次为真菌,占32%;有18%ESTs在GenBank中没有匹配的同源产物。蛋白功能分析表明,PIG28编码蛋白、ABC转运子、金属硫因、泛素、质膜H⁺-ATPase和氨基酸透酶等可能参与了寄主与病原菌互作过程。     

玉米矮花叶病毒特性及受侵叶片的超微结构

对玉米矮花叶病毒的病毒粒子形态、结构及其特性，感病叶片的超微结构进行了初步的研究。提纯病毒研究结果表明，MDMV粒子形态为线状，宽度为14nm，长度不等，完整粒子长度为720～750nm。病毒悬浮液经紫外扫描获得了典型的核蛋白紫外吸收光谱，最高吸收峰在257．5nm，最低峰在243．3nm，O．D280/O．D260约为0．73。在电镜下观察感病叶片的超微结构，可在细胞质内观察到大量的病毒粒子及风轮状、柱状内含体，体现了马铃薯Y病毒组的典型特征。同时，在感病组织内还可看到许多破坏的叶绿体、线粒体等。     

小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1,扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。     

用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库

为筛选枯草芽孢杆菌EDR4拮抗相关基因,利用转座子TnYLB-1构建该菌株的插入突变体库。通过对种子液OD600值、转接培养液Ⅰ继续培养OD600值及转接培养液Ⅱ后的孵育时间3因素设计正交试验,转化过程中加入pMarA质粒的不同量及质粒与感受态细胞共培养的不同时间研究2因素对转化效率的影响,确定pMarA对EDR4的转化体系。通过50℃高温诱导培养产生EDR4的插入突变体,挑取单菌落2 756个,构建EDR4的插入突变体库,随机挑选14株突变体经PCR检测转座子TnYLB-1序列,发现转座子已成功插入到EDR4基因组中;进一步通过Southern杂交验证,发现转座子TnYLB-1主要以单拷贝形式随机插入,也有部分多拷贝插入。此突变体库的建立可为以后筛选该菌株拮抗相关基因等研究奠定基础。     

玉米矮花叶病毒株系、寄主范围及辅助成分的研究

对纯化的玉米矮花叶病毒进行株系鉴定，因人工接种约翰逊草不侵染，故定为MDMV-B株系；4科36种植物的接种试验表明。19种禾本科植物可作为其其寄主，以不同病毒汁液进行的蚜虫薄膜饲毒试验表明，存在不同于Con A的一种辅助成分。     

内生细菌EDR2的鉴定及其对油菜菌核病的防治

【目的】明确内生细菌EDR2菌株的分类地位以及对油菜菌核病的防治作用,为该菌株的进一步应用奠定基础。【方法】采用皿内和温室盆栽试验,测定菌株EDR2对油菜菌核病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用以及对病害的防治效果;并结合菌体形态观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定该菌株的分类地位。【结果】内生细菌EDR2菌株能够有效抑制油菜菌核病菌的菌丝生长,并可导致菌丝出现畸形、细胞质外渗,同时其还对病菌的菌核萌发具有较强的抑制作用,培养原液的抑制率可达到96.6%。温室盆栽试验结果表明,菌株EDR2的培养原液和无菌培养滤液对苗期油菜菌核病均有良好的防治效果,其防效都在80%以上;菌株EDR2的喷施时间可影响其防治效果,其中以接种病菌前1d喷施防治效果最好,可达到95.4%;培养原液及不同倍数稀释液对病害的防治效果明显不同,随着稀释度的增加,其生防效果降低。菌株EDR2对供试的16种植物病原菌的菌丝生长均表现出一定的抑制作用,表现出较广的抑菌谱。结合形态和培养特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果认为,内生细菌EDR2属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】综合皿内及温室盆栽试验结果认为,内生枯草芽孢杆菌EDR2是1株对油菜菌核病具有较好防治潜力和开发前景的生防菌株。     

小麦黑胚病病原菌的分离及致病力差异的初步研究

对供试的6个小麦品种进行小麦黑胚病调查统计。结果显示,6个品种均有小麦黑胚病发生,前后两代籽粒黑胚率分别为 0.10%～21.10%和0.26%～25.22%,且不同品种间的发病程度存在差异。根据柯赫氏法则,分离所得主要病原菌为突脐蠕孢( Bipolaris sorokiniana )和细链格孢( Alternaria alternata ),分离率分别为6.67% 和76.67%;通过温室滴接试验,两种菌均能引起小麦黑胚病,突脐蠕孢和细链格孢的回接分离率分别为 99.50%和96.67%,前者的致病力比后者强;小麦黑胚病的两种主要病原菌从扬花期至乳熟期均可侵染,以扬花盛期和灌浆初期为侵染的最适时期。