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通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。 相似文献
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尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性 总被引:2,自引:1,他引:1
Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。 相似文献
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斑点叉尾鮰铁调素成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性 总被引:1,自引:0,他引:1
铁调素(hepcidin)是一种在动物肝脏中特异表达的碱性小分子抗菌肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱性密码子人工合成斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin成熟肽基因(mCH)。通过PCR方法在mCH的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,扩增到的目的片段与表达载体p PIC9K连接构建重组表达载体p PIC9K-mCH后,转化至毕赤酵母GS115细胞;以不同浓度梯度的G418筛选高拷贝转化子,1.0%甲醇、30℃、pH6.0诱导表达72 h,获得重组体mCH。结果显示,斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽区域含25个残基,8个保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端,表明该区域对hepcidin的抗菌活性具有重要作用。Tricine-SDS-PAGE分析显示,分泌表达的重组体mCH的分子量约为3 800D,通过阳离子交换层析获得纯化的mCH。抑菌实验表明,重组体抗菌肽mCH对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)有抑菌活性。本研究首次实现了斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为其产业化制备提供了重要的基础资料。 相似文献
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