猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究

利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表达产物包涵体，再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌，和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫BALB／c小鼠，间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素I、Ⅱ、Ⅲ的EuSA抗体和7型菌的血凝抗体，第2次免疫2周后用5LDso的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高，用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83．3％和91．7％，从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株，初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力，为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。     

抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用本室构建的质粒PGEX-ORF2特化BL21（DE3）．经IPTG诱导表达．得到PCV2-ORF2的重组蛋白，经复性纯化后作为免疫原．采取常规免疫与体外脾脏免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／0的骨髓瘤细胞融合．经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，获得了2株抗PCV2-ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞．分别命名为382F4和9C3132，其细胞培养上清效价分别为1：1024、1：512，小鼠暖水效价分别为1：204800、1：102400。ELISA结果显示，382F4和9C3D2仅与融合表达的PCV2-ORF2蛋白反应，而与PGEX-KG表达的蛋白、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不反应．说明此2株单抗特异性好。间接免疫荧光结果显示．382F4和9C3D2能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应．表明所获得的2株单抗是PCV2型特异性的。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能．及建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了强有力的手段。     

严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒基因组比较分析与进化研究

“严重急性呼吸道综合征”(SARS)由于危害严重，引起人们的高度重视，在各国科研人员努力下，目前已完成了十几个毒株的分离与全基因组测序工作。本研究对世界各地分离的SARS毒株的基因组全序列进行比较，发现不同毒株的同源性在99．8％以上，SARS病毒的遗传稳定性较高；将SARS病毒与其它冠状病毒基因组以及编码蛋白质序列进行比较分析，证实SARS病毒是一种新的冠状病毒，可能进化起源较早，并发现SARS病毒和牛冠状病毒同源程度最高。SARS病毒orflab、orfla、S、M、N编码区氨基酸序列和牛冠状病毒同源程度最高，鼠肝炎病毒次之。     

伪狂犬病病毒Ea株gM和gN基因的克隆与结构分析

gM和Ng是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒（PRV）第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列，设计两对分别包含gM和Ng完整编码的特异性引物，以PRV国内地方分离株（Ea株）的细胞感染物为模板，PCR扩增出大小约1．2kb和0．3kb的特异性片段。将扩增物克隆到杆状病毒转座载体pEastBacl中，酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明：Ea株gM、Ng基因分别编码394和98个氨基酸，与Ka株的同源性分别为98．4％和97．6％。DNATool和DNASIS软件对gM、Ng进行二级结构预测，发现gM存在8个潜在跨膜区和一个N－糖基化位点，是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白；gN具有N－端信号肽序列、C－端跨膜区和潜在0－糖基化位点，属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、Ng的相互作用位点及二聚体的功能奠定了功能。     

鸭源禽流感病毒的分离鉴定及特性研究

从湖北某鸭场采集泄殖腔棉拭子20份,通过传统的禽流感病毒分离方法即鸡胚尿囊腔接种法分离到1株鸭源禽流感病毒(AIV).血清学试验表明,该病毒分离株为A型流感病毒,经血凝素亚型鉴定为H9型,与禽流感病毒H9亚型标准阳性血清的血凝抑制(HI)价为8 log2,电镜负染拍照后,可清楚观察到典型的流感病毒粒子形态;致病性试验表明,该流感病毒对鸡表现为较低的致病力.研究表明,水禽,特别是鸭,正日益成为禽流感的高度易感动物,是AIV生态循环中重要的一环.     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

设计了一对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养，然后挑菌做PCR，同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果，从不同省(市)送检的病料中分离鉴定出66株多杀性巴氏杆菌，PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合；该引物对其他6种猪的常见呼吸道病原菌扩增均为阴性；该PCR检测方法能检测出cfu为10^3的巴氏杆菌模板。     

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶（LDH）基因序列设计1对引物，PCR扩增LDH基因，首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上，然后连接到表达载体pGEX—KG上，经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在。将超声波破碎的诱导菌液高速离心，其上清用Glutathione Sepharose4Bbead亲和层析纯化。用猪肺炎支原体的标准阳性血清对纯化蛋白作Western—blot检测，出现目的条带；以纯化蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，较高的特异性与敏感性。用建立的ELISA方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试荆盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为92．5％。用建立的ELISA方法检测了671份临床送检不同年龄阶段的猪血清，结果显示断奶前仔猪猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopnenmoniae，MHP）感染率为44．3％，保育猪为3．0％，育肥猪为17．44％，种猪为73．41％，这初步反映了猪喘气病在各个年龄阶段的感染率。