我国人兽共患病毒病现状与防控

近年来,传统传染病卷土重来,新发传染病威胁加重,人兽共患病毒病逐年增多,特别是禽流感、口蹄疫、非典型性肺炎、疯牛病、副粘病毒、狂犬病及多种虫媒病毒病等.疫情席卷而至,传播迅速、死亡率高,造成畜牧业生产、国内外贸易和人类健康,造成空前打击和严重威胁,给社会稳定带来极大危害.另表明,从20世纪70年代以来,新发现的拉沙热、埃博拉出血热、马尔堡出血热等诸多侵袭人类的病毒病,其疫源均追查到动物.     

应用实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测口蹄疫病毒

按照口蹄疫病毒(FMDV)聚合酶3D基因序列,设计合成了引物和探针,经各反应务件的优化,建立了实时荧光定量RT-PcR技术,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果,用300nmol／L的引物浓度和200nmol／L探针浓度,获得的CT值较小,而△Rn最大;可检测到相当于9．1TCID50的病毒RNA;与VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0．984;组内和组间试验重复性的变异系数(CV)分别为5．4％和6．7％;与常规RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

重组鸡痘病毒vFV282疫苗株理化特性测定

将重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 经酸、碱、热、氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,接种到CEF上,观察处理前后重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 毒力活性的变化,分析这些理化因子对重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 的影响。结果在pH 3.0~pH 9.0 范围内,pH变化不会造成该重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282毒力活性的显著变化。该重组鸡痘病毒疫苗株vFV282经50 ℃ 60 min、55 ℃ 30 min或60 ℃ 15 min即可被灭活,对氯仿敏感,经胰蛋白酶37 ℃作用 1 h,TCID50降低 2.55 log TCID50/0.1 mL,对乙醚不敏感,经乙醚作用24 h, TCID50下降1.0 log TCID50/0.1 mL。     

O型口蹄疫病毒O/LZ株拯救

以构建的口蹄疫病毒O／LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT—PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。     

关于水貂肠炎病毒结构蛋白基因5'-非翻译区调控其基因表达的评述

正水貂肠炎病毒(MEV)是细小病毒科细小病毒属的一种病毒,感染水貂引起水貂病毒性肠炎。作为感染真核细胞的最小DNA病毒之一,细小病毒基因组DNA仅有5 kb左右。为了利用有限的基因序列来完成病毒的复制周期,病毒利用了一些特殊的表达调控方式。比如:该属病毒成员(如:MVM,CPV)利用非结构蛋白NS1基因编码区的基因内启动子来调控结构蛋白VP1和VP2的表达;腺依赖病毒和浓核病毒利用leaky-scanning机制来表达衣壳蛋     

Asia 1 FMDV重组鸡痘病毒在豚鼠体内免疫原性和体内分布

为检测Asia 1口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)重组病毒免疫原性和安全性,将构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)基因的重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18间隔2周免疫豚鼠3次,进行特异性抗体、中和抗体、淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚类数量、IFN-γ、攻毒保护以及体内分布研究。重组鸡痘病毒可有效刺激豚鼠产生特异性抗体、中和抗体、T淋巴细胞亚类数量、IFN-γ分泌均显著高于对照组;重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的T淋巴细胞亚类数量、T淋巴细胞转化和IFN-γ分泌高于重组病毒rFPV-P1-2A-3C免疫组;2个重组病毒的攻毒保护率分别为4/5、3/5。2个重组病毒在接种最早12h可检测到重组病毒的基因,最晚7d可检测到重组病毒的基因。结果表明重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18具有良好的免疫原性,可以有效抵御病毒的攻击,体内残留时间短,对免疫动物安全,为开发、应用新型FMDV疫苗奠定了基础。     

SW-BSA人工抗原疫苗对山羊的免疫评价

10只山羊随机分为攻毒对照组和免疫攻毒组。免疫攻毒组山羊经过2次免疫,检测血清效价达到较高后,2组山羊同时饲喂甘肃棘豆草粉,进行攻毒饲喂试验。攻毒组山羊出现明显中毒症状后处死,进行病理组织学观察。免疫攻毒组继续饲喂试验,以观察疫苗的保护效果。分别测定血液中各项生化指标,并进行病理组织学检查。结果显示,攻毒组山羊于饲喂草粉的第15~20天出现典型的中毒症状,免疫攻毒组于第50~55天出现中毒症状,比攻毒对照组延缓30~40d;攻毒后,攻毒对照组山羊血液中生化指标迅速改变,而免疫攻毒组表现渐进性变化,其中苦马豆素（SW）浓度、AST、ALP、LDH、BUN、α-mannosidase活性分别比攻毒对照组延缓27、24、27、30、24、30d达到较高或较低点;中毒山羊组织器官出现以急性中毒性缺血、缺氧和空泡变性为特点的病理变化。结果表明,SW-BSA人工抗原疫苗对山羊疯草中毒有一定的免疫保护作用。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及临床样品的检测

采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。     

口蹄疫病毒重组鸡痘病毒活载体疫苗和DNA疫苗免疫牛的试验研究

将本课题组构建的共表达FMDV衣壳蛋白前体P1—2A基因以及蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及共表达P1—2A和猪白介索18基因的重组DNA疫苗（pVIRIL18P1），分别以单独及混合的共3种方式接种牛，然后通过间接ELISA、中和试验和T淋巴细胞增殖试验评价其诱导的特异性体液和细胞免疫水平。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导牛产生特异性的体液及细胞免疫应答。其中重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫组以及联合免疫组（vUTAL3CP1／pVIRIL18P1，pVIRIL18P1／vUTAL3CP1）诱导的中和抗体滴度分别达到1：64、1：64和1：54，已接近于常规灭活疫苗水平（1：90），而特异性的T淋巴细胞增殖反应则比后者高得多（P〈0．01）。该研究结果为进一步进行免疫攻毒试验，并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。