猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

山羊胎期肺的组织发生

研究了山羊胎期肺的组织发生，将肺的发育分为5个时期，（1）胚胎期（3－5周），肺芽分支形成主支气管，主支气管长度不断增长并萌芽出叶支气管，均衬以假复层柱状上皮；（2）腺状期（6－12周），以支气管树发育为主，小支气管及终蕾衬以假复层和／或单层柱状上皮；（3）小管期（13－14周），以呼吸部发育为主，原始肺泡开始形成，呼吸性细支气管和原始肺泡衬以末分化的立方上皮；（4）囊状期（第15周），呼吸部发育显著，肺内细支气管及其末端呈现出“充气”状态；（5）肺泡期（16－22周），以肺泡的形成和分化为主，肺泡上皮分化为扁平的肺泡I型细胞和立方形的肺泡II型细胞。     

奶牛β-酪蛋白基因5′和3′调控区的克隆及序列分析

利用普通及重组PCR技术克隆了奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5′调控成分(2826bp)和3′调控成分(620bp)。前者包括5′上游调控序列、第一外显子及部分第一内含子;后者主要包括最后一个不翻译的外显子和3′侧翼序列。纯化PCR产物通过pMD18-TVector亚克隆后测序并进行软件分析的结果表明,2个克隆片断与奶牛CSN2相应区域同源性分别为99.0%和98.0%,并且包含有全部的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点。     

成体干细胞的可塑性

传统观念认为,成体干细胞只能分化成其自身来源组织的细胞类型。但近年大量的研究表明,成体干细胞可跨系甚至跨胚层分化成在发育上与之无关的其他组织的细胞类型,即具有可塑性。文章对成体干细胞可塑性的研究结果、分化机制、应用前景及需解决的问题等进行了综述。     

体外培养的山羊乳腺上皮细胞形态研究

通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片,呈蜂窝状;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞;部分细胞表面出现绒毛状突起;接触抑制的上皮细胞形态不均一。     

山羊胚胎脊髓胶状质的形成和发育

对山羊胚胎脊髓胶状质发育的形态学变化了系统研究，结果表明：（1）山羊脊髓胶状质在胚胎第17周以后逐渐较多的神经元胞体和较大的淡染的神经元细胞核，提示胚胎第17周龄是山羊脊髓胶状质神经元发育的关键时期；（2）山羊脊髓胶状质内神经纤维在胚胎第11周时就已出现，而在髓神经纤维的髓鞘则在胚胎第15周时形成，以后逐渐发育成熟；（3）山羊脊髓胶状质的胶质细胞发育较早，在胚胎第6周末胶状质的胶质细胞发育较早，在胚胎第6周末胶状质原基刚形成时，胶质细胞核已经开始分化，到胚胎第18－19周时，胶质细胞又出现一个增殖高峰。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化

利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。     

妊娠中期猪羊水来源干细胞EGFP基因转化及体外分化

本研究旨在获得妊娠中期猪羊水来源千细胞,并通过用EGFP对干细胞进行标记,为以EGFP作为示踪标记对干细胞进行体内移植研究奠定基础.利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄60 d猪胎儿羊水中分离获得干细胞,通过脂质体介导转染将EGFP基因导入干细胞,诱导转基因干细胞向肌细胞和神经细胞分化,观察其分化特点.采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出妊娠中期猪羊水来源干细胞,并获得转EGFP基因干细胞.干细胞在表达EGFP的同时仍具有分化潜能.干细胞中Oct4、CD-90和Sox2表达阳性;体外诱导的干细胞能分化为肌细胞(表达myf-6和myoD)、星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).研究表明,从妊娠中期猪胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP对羊水来源干细胞进行标记、追踪,为EGFP作为示踪标记对干细胞用于体内移植研究奠定了基础.     

妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化

从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志.结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能.