奶水牛牛分枝杆菌的分离与鉴定

从患疑似结核病的广西奶水牛群中进行牛分枝杆菌的分离和鉴定。共收集了238份临床样品(鼻黏液及牛奶),病料经1.25 mol/mL NaOH溶液预处理后,接种罗氏培养基进行细菌分离。分离菌经进一步纯化后进行抗酸性染色并镜检,镜检后判为阳性的细菌再接种到鉴别培养基上进行鉴别培养,同时,应用PCR方法对镜检为阳性的细菌进行进一步的鉴别检验。结果收集的所有临床样品,经37℃培养后共获得细菌12株。这12株菌经抗酸性染色后镜检都为分枝杆菌阳性,进一步经鉴别培养基鉴定12株菌中有2株为牛分枝杆菌,其余均为非典型分枝杆菌。2株牛分枝杆菌经PCR方法鉴定得以确诊。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌（M.bovis）CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100％。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。     

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列,筛选了特异性探针引物组,采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化,并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较,同时对其他常见禽病病原体进行检测,以及对40份临床样品进行检测,评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍,最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测,结果均为阴性;批内和批间重复性较好,变异系数小。结果表明,所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性,可成功用于快速定量检测ChPV感染。     

血清4型禽腺病毒水平感染SPF鸡的致病性研究

为研究血清4型禽腺病毒(FAdV-4)通过水平传播途径感染SPF鸡的致病性,将3周龄SPF鸡饲养于FAdV-4不同污染程度的隔离器中以建立自然感染动物模型,每天记录疾病过程并统计发病率和死亡率,剖检并检测器官病毒载量,检测环境和鸡躯体表面的FAdV-4病毒载量。结果显示：FAdV-4水平感染SPF鸡的第1～4天无明显临床症状,第5天起饮食量下降、排黄绿色粪便,第6～9天陆续有鸡死亡,第10天后鸡群逐渐康复至与对照组相同;FAdV-4具有广泛的组织嗜性,在肝脏中含量最高;环境中FAdV-4的污染程度对鸡群的发病率和死亡率均有影响,每25 cm²地网的病毒载量为1.4×10⁵ copies、侧壁为2.3×10³ copies、料槽为1.2×10⁴ copies时将达到环境致病阈值,此时每25 cm²鸡体表病毒载量为脚底1.2×10⁵ copies、头部1.1×10⁴ copies、背部3.7×10³ copies。本...     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

应用RT-PCR检测人工感染鸡体内禽呼肠孤病毒的动态分布

应用一步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测禽呼肠孤病毒(ARV)在人工感染SPF雏鸡体内的动态分布情况。结果3日龄感染ARVS1133毒株后,12h就可以从关节、肝、脾等组织中检出病毒的RNA,感染后3—7天为检出的高峰期,至感染后27天还可从附关节组织检测到：在11种不同绀织中．均不同程度地检测到病原的核酸,其中以关节组织检出率最高(80．9%),其次为肝(67．6%)、脾(55.9％)、肾(50．0％),肛门棉拭子的检出率最低(13．2％),显示了ARV在感染机体内的动态分布情况。     

鸡传染性贫血病PCR试剂盒技术的研究及应用

根据鸡传染性贫血病毒（CIAV）的VP1、VP2基因序列的结构特点,设计合成了一对引物,建立了检测鉴别鸡传染性贫血病毒PCR技术,并研制出CIAV—PCR检测试剂盒。试验结果显示,该CIAV—PCR检测试剂盒对参考菌株和地方分离株均能特异性地扩增出420bp条带,而对其他禽病病原体的扩增结果为阴性;该CIAV—PCR试剂盒最低能检测出10fg的CIAV DNA模板;保存期测定结果显示,在-20℃条件下保存至1、3．6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到10～100fg的CIAV DNA模板,保存至12个月时其敏感度虽然降低了1个滴度,但仍能100％检出人工感染鸡的临床样品。表明该CIAV—PCR检测试剂盒对CIAV临床样品的检测具有特异、敏感、快速和准确的特点,适合在临床生产中推广使用。     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。