鸡白介素18成熟蛋白的发酵工艺及其对新城疫疫苗的免疫增强作用

为探讨重组鸡白介素18（mChIL-18）毕赤酵母工程菌在5L发酵罐中大规模发酵的工艺及其对新城疫疫苗的免疫增强作用,复苏工程菌GS115/pPIC9K-mChIL-18于YPD培养基,在其D600值达到5.2左右时转入发酵罐中,采用分批补料方式对毕赤酵母工程菌进行高密度发酵。控制和优化各种发酵条件,经历84h结束发酵。将发酵液离心,用6×His镍柱对上清中的表达产物进行纯化,并将纯化后的mChIL-18用脂质体包被后和新城疫疫苗一起对鸡群免疫。结果显示,毕赤酵母工程菌在5L发酵罐采用甲醇诱导补料批式发酵,在pH5.5,溶氧值20%～30%,温度28℃,诱导72h,mChIL-18的表达产量为560mg/L,发酵上清经纯化后纯度可达70%以上;用0.2mL的mChIL-18脂质体能够显著增强机体的免疫力,其中HI抗体效价和淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋含量均显著高于对照组。这表明mChIL-18毕赤酵母工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,并能显著增强新城疫疫苗的免疫效果,为IL-18在生产实践得到更好的应用奠定了基础。     

白色假丝酵母性乳房炎的病原分离鉴定及治疗

对使用中药和多种常规抗生素治疗均无效的患乳房炎奶牛 ,无菌采集奶样进行病原学鉴定 ,病原菌为白色假丝酵母菌 ;药敏试验发现酮康唑敏感 ,用敏感药物酮康唑对患牛治疗后 ,症状明显减轻 ,产奶量回升     

MTT法检测鸡脾脏和外周血NK细胞杀伤活性的条件优化

选取不同日龄的SPF鸡和肉鸡,用贴壁法从血液和脾脏分离出NK细胞作为效应细胞,选择瘤细胞MDCC-MSB1和MDCC-MSBCU147分别作为靶细胞,二者按比例混合,孵育,利用MTT法检测靶细胞的活力反映效应细胞对靶细胞的杀伤活性,并对效靶比、作用时间进行比较.结果显示,MSB-1和CU147均可作为NK细胞良好的靶细胞,但CU147更稳定;效靶比为20:1～50:1,作用时间8～16 h杀伤效果稳定;50%DMF-20%SDS混合物作为裂解液能够对结晶彻底溶解,优于其他溶解试剂.     

羊白细胞介素-18成熟蛋白的酵母表达和生物学活性研究

为了研究重组羊白细胞介素(gIL)-18在酵母系统中的高效表达,进一步阐明该重组蛋白的生物学活性,以含有gIL-18基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,构建重组表达质粒pPICZ-gIL-18,转化于毕赤酵母GSll5,以甲醇诱导表达,经sDS-PAGE和western blot分析证实了重组蛋白的表达,分泌的重组gIL-18表达量为100 mg/L.经纯化后用MTT法和MDBK-VSV法检测表达的重组IL-18体外生物活性,利用免疫试验检测了重组蛋白对羊痘疫苗的免疫增强作用.实验结果表明,该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性,比活性为1.5×105 u/mg.体外具有增强羊痘疫苗的活性.毕赤酵母分泌表达的重组gIL-18具有良好的生物学活性,为gIL-18作为免疫佐剂和免疫治疗剂的大规模应用奠定了基础.     

以奶山羊为实验动物模型治疗白色念珠菌性乳腺炎的研究

以健康泌乳奶山羊为实验动物模型,进行了白色念珠菌性乳腺炎的治疗试验。将30头奶山羊分为发病用药组,发病未用药组和健康对照组。给发病用药组和发病未用药组同时乳导管注射1mL的白色念珠菌的菌液,结果在48h后均出现不同程度的炎症反应。并从患羊乳汁中分离到白色念珠菌。给发病用药组用水煎的自拟中药方剂灌胃,5d后发病用药组症状明显减轻或消失,精神状况明显好转。分别于用药前后对30只奶山羊进行颈静脉采血用于血流变学分析和淋巴细胞转化试验,并分别于用药前后对30只奶山羊采集奶样进行乳成分分析,结果发病用药组的各项健康指标均接近或达到正常。但产奶量比健康对照组稍低。而未用药组的各项健康指标仍显著低于正常水平,证明本方剂对白色念珠菌性乳腺炎具有有效的治疗效果,为进一步研究由白色念珠菌引起的奶牛乳腺炎的治疗提供了试验依据。     

H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。     

中药免疫调节剂体外细胞毒性测定

采用形态学观察和MTT两种方法,测试了中药免疫调节剂(TJJ)在鸡胚成纤维细胞(CEF)和小鼠纤维母细胞(L929)体外培养中的最大安全浓度。结果表明:⑴TJJ的细胞毒性很低,对CEF和L929的最大无毒浓度分别达3.12g/L和1.56g/L;⑵两种细胞比较,L929对药物毒性的反应性较CEF更敏感;⑶两种方法比较,MTT法更灵敏、更客观;⑷在同一种细胞的不同生长状态下(形成单层前后)加入TJJ,药物对细胞的毒性结果无变化,说明药物对细胞的毒性与细胞种类有关,而与细胞的生长状态关系不明显。     

牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒（BRV）与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的双重RT-PCR方法。应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp。说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究。     

用菌体凝集抑制试验诊断羊伪结核病

将羊伪结核棒状杆菌用吐温－８０等化学试剂进行处理，使菌体分散的单个细胞均匀地悬浮于溶媒中，制备为抗原。然后用其与已知的阳性及阴性血清进行试验，探讨诊断羊伪结核病的快速、简便方法，即菌体凝集抑制试验。结果，供治疗试验用的３０只羊在人工接种伪结核棒状杆菌后的第２￣１３周，有２８只羊的血清一直呈现非凝集或沙粒状凝集，即阳性反应；２只羊的血清一直呈现絮状凝集阴性反应。该期间的患羊检出率为９３％。而由屠宰场