心包积水-肝炎综合征转归的病理学观察

为研究心包积水-肝炎综合征（HHS）的转归，试验采用血清4型禽腺病毒感染4周龄SPF鸡，建立发病率为90%、死亡率为20%的动物模型，观察SPF鸡大体病变并采集肝脏、心脏、脾脏、腺胃、胰腺、肺、肾脏、法氏囊、胸腺、脑、肌肉、小肠、肌胃、食管和气管制作组织病理学切片，检测组织样本中的病毒载量。结果显示：心包积液完全吸收，腺胃出血消失，脾脏轻微肿胀，肝脏仍存在部分黄染和肿胀，组织学检查发现肺脏已完全恢复，肝脏、法氏囊、胸腺、脾脏仍存在组织变性坏死及广泛的炎性细胞浸润；转归期后器官的病毒含量均显著降低（P<0.05）。结果表明HHS的转归为不完全痊愈，对肝脏及免疫器官的功能将造成长期影响。     

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡，引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求，建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法，使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物，使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系，优化探针浓度和反应温度，使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验，最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示，建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min，可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA，并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料，发现有3份ARV阳性，与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明，本研究建立的ARV RT-R...     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用

为绝对定量滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS），试验根据已发表的MS VlhA基因序列，针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针，建立了ddPCR定量检测MS的方法，并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：建立的方法最佳引物浓度为20μmol/μL，最佳探针浓度为10μmol/μL，最佳退火温度为54℃；该方法仅检测出MS毒株，不能检测出其他禽源病原，MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/μL,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示，该方法的MS阳性检出率（11.1%）高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明，建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好，为绝对定量MS提供了适合的技术手段。     

二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段，设计了2套LAMP引物，并各添加1条FD荧光探针，2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光，MS阳性对照发出绿色荧光，双重模板经过图像融合后为黄色荧光；特异性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原，对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应；敏感性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10² copies和1.9×10² copies;使用该方法检测40份临床样品，检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上，该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果，为不同条件的实验室提供了新的检测手段。     

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒（AIV）的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法，从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列，采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物，通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系；利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验；采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明，成功建立了一种同时检测H7亚型（723 bp）和N2亚型（314 bp）AIV的nano-dPCR方法，该方法特异性良好，其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带，H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL，其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍，其对临床样品检测结果准确率达到100%，可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。     

广西鸡源肠炎沙门氏菌的分离与鉴定

对广西壮族自治区3个鸡场疑似沙门氏菌感染发病鸡进行细菌分离，并对分离菌株进行染色镜检、生化实验、血清学鉴定、DNA测序、动物回归试验和药敏试验。结果共分离到6株沙门氏菌，生化特征和血清学特征符合肠炎沙门氏菌特性；DNA测序结果与肠炎沙门氏菌同源性为100%;动物回归试验表明，分离菌株能致死SPF鸡，并复制出与临床表现一致的病例；药敏试验结果表明，分离菌株对诺氟沙星和阿米卡星高度敏感，为广西地区鸡源沙门氏菌病的防治提供参考依据。