鸭 I 型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法.该方法对同一样品中的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的202 bp(鸭I型肝炎病毒)和474 bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到100 fg的鸭I型肝炎病毒RNA和番鸭细小病毒DNA.研究建立的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测.     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.     

禽呼肠孤病毒感染SPF鸡后免疫器官中IL-18的定量检测

[目的]掌握禽呼肠孤病毒(ARV)感染SPF鸡后免疫器官中白细胞介素18(IL-18)的相对动态转录时相,为揭示ARV的致病机制奠定基础.[方法]利用鸡IL-18实时荧光定量PCR检测分析ARV感染对SPF鸡免疫器官中IL-18mRNA动态转录水平的影响.[结果]SPF鸡感染ARV后,免疫器官发育不良,其脾脏、胸腺、法氏囊重量均低于对照组.与对照组相比,除感染后21d的胸腺、法氏囊和35 d的脾脏、胸腺中IL-18表达下调外,其他时间点免疫器官中的IL-18均表达上调,且都在ARV感染后第1d达峰值,上调倍数分别为3.59(脾脏)、7.99(胸腺)和8.35(法氏囊)倍.[结论]ARV感染可导致IL-18转录时相发生变化,推断IL-18与ARV对免疫器官的损伤与免疫抑制相关.     

广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定

在广西2处网箱和2处池塘发病斑点叉尾鮰中分离到4株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养特征、生理生化特性鉴定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌,通过PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对,进一步确定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌;致病性试验结果显示,这4株分离菌株具有较强的致病性,能引起斑点叉尾鮰发生爱德华氏菌病;药敏试验结果显示,4株分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氟哌酸等高度敏感。     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析

利用IBVS1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用DNAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB/02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、cal15、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB/02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌灭活菌苗免疫保护及药物治疗试验

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌培养物经甲醛灭活后,制成灭活油乳剂苗、灭活菌苗、饵料吸附型疫苗,免疫罗非鱼2周后,分别以嗜水气单胞菌、爱德华氏菌活菌液攻毒,结果显示,注射型疫苗均优于口服型,其中嗜水气单胞菌以腹腔注射0．1mL嗜水气单胞菌灭活菌苗＋0．3mL生理盐水的效果最佳,免疫保护率为85．0％;而爱德华氏菌以腹腔注射0．4mL灭活油乳剂苗效果最佳,免疫保护率为90．0％。两者的药物治疗试验结果显示,以氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸治疗罗非鱼嗜水气单胞菌病、爱德华氏菌病均有一定效果,对减少发病率及死亡率、控制病情具有较好作用,其中以氟苯尼考的疗效最佳,其用量为20mg／kgH2O。     

牛轮状病毒二温式PCR检测方法的建立

根据牛轮状病毒（Bovine rotavrius,BRV）的群特异性基因VP6设计了1对特异引物,建立并优化了能够快速检测BRV的二温式PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,该二温式PCR只对BRV敏感,可扩增获得大小为385 bp的特异性条带,其敏感性为最低能检测到1 pg的BRV RNA;而对其他病毒不敏感。说明所建立的BRV二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

重组禽呼肠孤病毒S1133 σ3基因表达及其免疫原性研究

[目的]构建禽呼肠孤病毒(ARV)S1133 σ3基因的真核重组质粒,研究其表达蛋白的免疫原性,为研发ARV基因疫苗奠定基础.[方法]采用RT-PCR对ARV S1133毒株的σ3基因进行RT-PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后,转化大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒的DNA,经双酶切、PCR扩增鉴定和纯化.以阳性重组质粒pcDNA3.1-σ3免疫7日龄SPF雏鸡,同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照,二次加强免疫两周后,采用Western blotting检测鸡群血清抗体;并用S1133毒株进行攻毒,4 d后进行ARV检测.[结果]重组质粒pcDNA3.1-σ3的双酶切和RT-PCR扩增鉴定结果一致,均能扩增出约999 bp目的条带;免疫攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%,pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P<0.05),但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P>0.05);病毒检出部位最高是关节,其次是胸腺和肾脏,胸腺检出率为零.[结论]真核表达ARV S1133 σ3蛋白具有较好的免疫保护,可作为免疫抗原进行下一步的疫苗中和试验.