猪成纤维细胞转染方法的比较

以EGFP为报告基因,比较脂质体法与磷酸钙法对广西陆川猪胎儿成纤维细胞进行转染的效率.结果发现:利用脂质体法、磷酸钙法转染35 mm培养皿培养的细胞,分别得到15、13个阳性细胞集落.利用2种方法对猪胎儿成纤维细胞进行转染均可行.     

水牛Follistatin cDNA克隆及序列分析

卵泡抑索（Follistatin,FS）可通过旁分泌和自分泌的方式抑制促卵泡素（FSH）的分泌,从而影响动物的繁殖机能。本研究拟通过分析水牛的FS cDNA序列来分析其繁殖性能低的可能原因。试验参照GenBank公布的奶牛的FS cDNA序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增目的基因,再将其亚克隆到pMD-18T克隆载体进行测序。测序结果显示本试验成功获得了水牛的FS cDNA序列。同源性及进化树分析提示FS在哺乳动物进化上高度保守。研究发现两处氨基酸的突变,这可能影响FS正常的生物学功能发挥,从而影响水牛的繁殖机能。     

陆川猪MYL2基因生物信息学分析、真核表达载体构建及组织表达研究

【目的】了解陆川猪肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)基因CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,探究MYL2基因对肌肉生长发育的影响,为陆川猪的开发利用提供分子基础。【方法】采用RT-PCR技术扩增陆川猪MYL2基因CDS区,利用MegAlign软件对陆川猪MYL2基因与不同物种进行相似性比对和系统进化树构建,并通过生物信息学软件分析MYL2蛋白理化性质、疏水性和跨膜结构等;构建MYL2基因真核表达载体,利用脂质体法将重组质粒转染C2C12细胞并观察荧光;通过实时荧光定量PCR检测MYL2基因在陆川猪不同组织中的表达情况。【结果】陆川猪MYL2基因CDS区全长501 bp,编码166个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MYL2基因相似性为99.6%,存在2处突变：156 bp处C突变为T,为同义突变;404 bp处T突变为C,使异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。生物信息学分析显示,MYL2蛋白原子总数为2 633个,分子质量为18.879 ku,理论等电点(pI)为4.83,不存在跨膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。MYL2蛋白有16个位点可能会被磷酸化,在第...     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1,GPR1）基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

猪德尔塔冠状病毒致病机理及防治研究进展

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。深入开展PDCoV的研究对该病的防控有重要意义。PDCoV基因组编码的4种结构蛋白、15个非结构蛋白和3个辅助蛋白在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。PDCoV致病机理复杂,笔者从其侵入宿主细胞以颉颃干扰素反应、诱导细胞凋亡、调控细胞自噬、抑制细胞焦亡途径来逃避宿主免疫应答,以及其他影响PDCoV复制的分子机制方面对其致病机理进行总结。PDCoV呈全球性流行趋势,常用S、M和N基因作为核酸检测和抗体检测靶标进行诊断。目前,尚未开发出针对PDCoV的安全有效的商品化疫苗和治疗方法,随着生物技术的发展,在灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、重组载体疫苗、病毒样颗粒疫苗和乳酸菌载体口服疫苗上取得一定进展,且广谱抗病毒药物、抗病毒分子蛋白和新型抗病毒技术在PDCoV抗病毒研究中显示了良好的应用前景。因此,笔者总结PDCoV编码蛋白功能、致病机理、诊断方法及PDCoV的疫苗开发和抗病毒治疗,以期为后续科学研究和有效防治提供借鉴。     

广西德保猪MC1R基因的克隆与分析

近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列（GI：347618788）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。     

水牛精原细胞的体外培养及分化

以探讨水牛精原细胞体外培养的发育潜能为目的,对3～5月龄水牛睾丸组织进行精原细胞与支持细胞的体外共培养.两步酶法消化睾丸组织来制备水牛生殖细胞悬液,接种于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养30 d,观察细胞的生长和形态变化,并对培养4周的细胞进行RT-PCR分析,以检测PRM-2和TP-1基因的表达情况.结果显示,水牛精原细胞体外培养24 h后,精原细胞(10.0～12.5μm)呈圆形并紧贴支持细胞上;养7～8 d后.精原细胞出现聚集状态;养10 d后,有细胞克隆形成;养30 d后,出现似长形精子细胞(8.0～10.0μm).对培养4用后的细胞进行RT-PCR分析,精子细胞特异表达基因PRM-2被检测出来.结果表明,采用本试验体外培养条件对水牛精原细胞进行培养,能够满足精原细胞体外长期培养的需要,并可以发生增殖与分化而形成似精子细胞.     

性别对杜陆猪肉品质及风味影响的代谢组学分析

试验旨在了解不同性别杜陆猪不同组织的代谢差异及这些代谢差异对肉品质和风味产生的影响,为性别因素对猪肉品质和风味研究方面的影响提供基础代谢依据。试验选取16头（公母各半）8月龄、体重相近的杜陆猪,采用气相色谱质谱联用技术（GC/MS）对公猪和母猪血液、肝脏、背最长肌组织代谢物进行非靶向代谢检测,并运用代谢组学分析技术进行代谢模式差异分析、差异代谢物筛选和差异代谢物代谢通路富集分析。结果表明,性别对杜陆猪血液、肝脏、背最长肌组织总体代谢模式有一定的影响;性别差异引起的血液和肝脏差异代谢物数量较多,背最长肌最少。公猪血液多数脂类差异代谢物浓度显著高于母猪（P<0.05）,而肝脏则相反（P<0.05）。公猪血液和肝脏糖类差异代谢物浓度多数显著高于母猪（P<0.05）,其中公猪血液2-十八烯酸单甘油酯、二十二酸、胆固酮、二氢胆固醇的含量均为母猪的1.5倍以上;公猪肝脏β-龙胆二糖的含量是母猪的29倍,L-犬尿氨酸的含量是母猪的11倍,L-酪氨酸的含量是母猪的3倍。杜陆公猪肝脏硫辛酸含量显著低于母猪（P<0.05）,是母猪的50%。杜陆公猪、母猪血液和肝脏激素类、脂类、糖类、氨基酸类代谢通路均差异显著（P<0.05）。以上结果表明：杜陆猪血液、肝脏、背最长肌组织代谢物性别效应不同;杜陆猪血液和肝脏激素类、脂类、糖类、氨基酸类代谢通路均存在性别效应,但性别效应微弱。杜陆公猪血液、肝脏和背最长肌较高水平的脂类和糖类代谢物使其肉质和风味比母猪稍好。     

水牛生精上皮细胞的冷冻保存

为探讨水牛睾丸生精上皮细胞冷冻保存的适宜冷冻保护剂及其浓度,在DMEM中分别添加不同浓度的冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)、甘油(G)、丙二醇(PG)和乙二醇(EG),以及10%的胎牛血清(FBS),对3～5月龄水牛生精上皮细胞进行冷冻保存,解冻后台盼蓝染色测定细胞活率.结果显示,当以0%,5%.10%,15%,20%DMSO添加时,10%DMSO组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,20%,25%,30%,35%,40%G添加时,35%G组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,5%,10%,15%,20%,25%PG添加时,15%～25%PG各组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05),但以20%PG组为最高;当以0%,5%,10%,15%,20%EG添加时,5%～20%EG各组的细胞解冻后活率均显著高于0%EG组,但以10%EG组为最高;而对4种冷冻保护剂各最优浓度组的细胞解冻后活率比较,10%DMSO、35%G组的细胞活率均显著高于20%PG、10%EG组(P<0.05).结果表明,以添加10%DMSO或35%G于含10%FBS的DMEM冷冻液中,采用两步慢速冷冻,液氯保存,37℃水浴1 min解冻,是一种具有较高复苏率的冷冻保存水牛生精上皮细胞的方法.