鹿茸再生干细胞体外培养及核结合因子a1的检测

为了建立鹿茸再生干细胞的体外分离培养方法,进一步了解鹿茸再生、骨化等生理过程,本试验采用酶消化和组织块培养相结合的手段,成功进行了鹿茸再生干细胞的体外培养及传代扩增,对其生长曲线进行了初步分析,并对核结合因子a1(cbfa1)基因的表达情况进行了免疫细胞化学的分析,结果表明用酶消化和组织块培养法能够很好地获得鹿茸再生干细胞;鹿茸再生干细胞表达Cbfa1基因。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

梅花鹿Col Ⅹ基因的RNAi重组慢病毒载体的构建及鉴定

研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S3-plvthm上清液中病毒滴度分别达到9.96×107TU/L和7.18×107TU/L。以此病毒感染梅花鹿角柄骨膜细胞,并进行微粒体培养,72 h后出现肉眼可见的白色微团,该细胞团有荧光表达。本试验成功地构建了针对梅花鹿ColⅩ基因的慢病毒载体,为了研究Col Ⅹ蛋白在鹿茸角骨化中的作用奠定了基础。     

梅花鹿Col X基因的RNAi重组慢病毒载体的构建及鉴定

研究十型胶原蛋白(Collagen type X,Col X),在软骨内成骨过程中所起的作用.本研究针对梅花鹿ColX基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定.用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞.结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞.收集培养液后进行1 000 g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分.S2-plvthm/S3-plvthm上清液中病毒滴度分别达到9.96×107TU/L和7.18×107TU/L.以此病毒感染梅花鹿角柄骨膜细胞,并进行微粒体培养,72 h后出现肉眼可见的白色微团,该细胞团有荧光表达.本试验成功地构建了针对梅花鹿Col X基因的慢病毒裁体,为了研究Col X蛋白在鹿茸角骨化中的作用奠定了基础.     

鹿茸骨化机制的研究进展

鹿茸是鹿科动物头盖骨上的骨质性附属器官,为鹿科动物的第二性征.鹿茸的生长发育、钙化与长骨的钙化过程比较相似,因此鹿茸具有明显的作为骨钙化调节机制研究的潜在模型优势,主要表现:鹿茸上没有肌肉的附着,很容易观察和测量,适合进行活体检查;     

梅花鹿生茸区骨膜细胞基因片段测序分析

在已经构建的梅花鹿生茸区骨膜细胞cDNA表达文库的基础上对文库中的噬菌斑进行随机挑取筛选,对筛选出来的噬菌斑进行质粒亚克隆、鉴定及表达序列标签序列测定和生物信息学分析。通过随机筛选及生物信息学分析的方法发现,在梅花鹿生茸区骨膜细胞中有特殊意义的基因或者基因片段。随机挑选表达频率比较高的11个基因片段中有6个基因片段具有重要意义,对这6个基因片段进行了生物信息学分析,为进一步的鹿茸生物学研究打下了基础。     

Cbfa1基因结构与功能分析

核结合因子α1（cbfa1）是runt结构域基因家族的重要成员之一,编码一个成骨细胞特异性转录因子,调控成骨细胞发育、分化和骨的形成。cbfa1基因含8个外显子,但它的多个外显子存在选择性剪接,产生多样cbfal的异构体,具有不同的转录激活潜能。多条信号传导通路参与到cbfal的活性或表达的调控。本文主要从cbfa1基因的结构、功能、表达调控以及基因功能的影响因子等方面进行了综述。     

鹿茸干细胞与鹿茸再生

鹿茸是唯一能够完全再生的哺乳动物器官,因而成为良好的生物医学研究模型。研究发现,鹿茸的再生是一个基于干细胞的过程,其内在的生长机制和调控模式对再生医学等研究领域具有重大的意义。本文对鹿茸的组织学、形态学及鹿茸干细胞的发现/鉴定进行了总结,进而探讨了鹿茸干细胞内与再生相关的基因。     

鹿茸成骨过程及其相关调控机制研究进展

鹿茸是一种特殊的周期性再生的哺乳动物骨质器官。鹿茸的发生起始源于生茸区骨膜,通过膜内成骨、过渡成骨和特殊的软骨内成骨实现鹿茸的整个成骨过程。鹿茸的周期性再生及成骨过程是多种因素及信号通路综合调控下的生物学过程。笔者概述了鹿茸成骨过程的组织基础以及这一过程中相关激素、细胞因子和信号通路等的调控机制,以期为鹿茸成骨机制研究及提高鹿茸产量提供借鉴。