青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。     

患病大鲵类志贺邻单胞菌的分离与鉴定

从患病濒死大鲵(Andrias davidianus)肝脏中分离到1株病原菌YZ01,经Biolog微生物系统鉴定及16S rDNA序列的系统发育分析,均表明该病原菌为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。人工感染试验可致健康大鲵出现与自然患病大鲵相同的症状,并从感染患病大鲵体内再次分离到该病原菌。药物敏感试验表明,该菌株对头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素和头孢呋辛等18种药物敏感。     

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考.本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析.结果从患病中华鳖体内分离纯化得到...     

长江草鱼多态微卫星位点的分离及后备亲鱼的遗传多样性分析

本研究采用磁珠富集法分离了10对具有多态性的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)微卫星位点,并对140条长江野生草鱼组成的后备亲鱼群体的遗传结构进行了分析。结果显示:本试验得到的草鱼微卫星序列主要是以2个碱基为重复单位、重复次数在5～22之间的多重复单元,重复次数在10次以上的微卫星序列较易得到多态性;77个微卫星座位中,完美型、非完美型和混合型微卫星标记所占的比例分别为87.01%、2.60%和10.39%;群体遗传分析显示,10个多态性微卫星座位中,除了GC39座位外,其它座位都符合哈迪-温伯格平衡,适用于草鱼群体的遗传结构分析;每个座位检测到3～8个等位基因,平均有效等位基因数为3.9302,多态信息含量在0.4129～0.8107之间变动,平均为0.6678,除了GC78座位为中度多态外,其他9个座位均为高度多态。基因分化系数、Shannon指数、平均观测杂合度和平均期望杂合度的平均值分别为0.3457、1.4262、0.9511和0.7193,表明该群体的遗传多样性比较丰富。     

黄鳝atrogin-1蛋白表达及细胞定位研究

为提高黄鳝养殖效率以及肌肉的质量,进一步发掘黄鳝肌肉发育相关基因,以atrogin-1为研究对象,构建了3种原核表达载体:pCold-TF-atrogin-1、pET28a (+)-atrogin-1及pGEX6P-1-atrogin-1。将构建的重组表达载体转入Transetta(DE3)感受态细胞,重组菌株经诱导表达后,仅pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株表达出可溶性较高的重组蛋白。IPTG诱导试验结果表明,诱导剂浓度对蛋白质表达可溶性及含量几乎没有影响,诱导时间在20 h最佳。可溶性部分经Ni-NTA柱亲和层析纯化以及SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺)电泳,证实获得了重组蛋白。构建真核表达载体pEGFP-N1-atrogin-1,转染293T细胞,结果表明,atrogin-1融合蛋白在细胞质及细胞核中均有表达,且在细胞核中表达量相对较高。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。