草鱼出血病细胞疫苗微囊制备与体外释放研究

以海藻酸钠、壳聚糖以及草鱼出血病细胞灭活疫苗为原材料,采用复凝聚法制备草鱼出血病口服微囊疫苗。通过单因素试验和正交试验,研究了海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、氯化钙浓度以及加入疫苗体积对微囊疫苗包封率的影响,确定了其最佳制备工艺。结果显示,各因素对草鱼出血病微囊疫苗包封率的影响程度由大到小依次为：海藻酸钠浓度＞疫苗加入量＞壳聚糖浓度＞氯化钙浓度;制备草鱼出血病微囊疫苗的最佳工艺为：海藻酸钠浓度为1.5%,壳聚糖浓度为1%,氯化钙浓度为4%,加入疫苗体积为2 mL。该微囊疫苗平均粒径为（7.02±3.95）μm,平均包封率为60.53%,平均载蛋白量为8.12 mg/g,在pH 7.4的PBS溶液、生理盐水溶液中具有良好的释放性能。     

鲟鱼病原性疾病研究进展

鲟是地球上最古老的物种之一。我国自1991年后开始鲟类的商业化养殖,主要品种有引进的匙吻鲟、杂交鲟、小体鲟、俄罗斯鲟和西伯利亚鲟,黑龙江流域出产的施氏鲟、达乌尔鳇,以及施氏鲟和达乌尔鳇的杂交种等。随着养殖业的发展,鲟疾病不断增多,严重制约了养殖产业的健康发展。目前发现的鲟致病性病原有病毒、细菌、真菌和寄生虫等。概述了目前国内外鲟病原性疾病的研究进展,包括感染种群、致死率、临床症状、病原分离鉴定和药物控制等方面。目前对鲟病害的研究,在发病机制、免疫防治以及结合环境和营养因素的综合防控技术等方面还十分缺乏,应系统开展鲟疾病的流行病学、病原学、诊断技术以及防控技术研究。     

不同测定方法对聚维酮碘杀菌效果的比较研究

以6株黄鳝源嗜水气单胞菌分离株作为受试菌,研究聚维酮碘在两种测定方法下的杀菌率、有效碘含量,及其对黄鳝的急性毒性,评价不同测定方法的准确性及应用安全性。试验结果显示,采用试管二倍稀释法,在溶菌肉汤、营养肉汤和双倍浓度营养肉汤培养基中,聚维酮碘对6株菌的24h最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为24g/L(溶菌肉汤=营养肉汤≥双倍浓度营养肉汤)。采用直接作用法时,5mg/L和10mg/L聚维酮碘在10min内的杀菌率分别为99.99%、100%。试管二倍稀释法中有效碘的含量(溶菌肉汤营养肉汤双倍浓度营养肉汤)也远低于直接作用法,且有效碘含量在24h后均下降。聚维酮碘对黄鳝的24h半致死质量浓度为173.91mg/L,这一质量浓度远高于直接作用法测定的有效杀菌质量浓度。试验结果表明,聚维酮碘对嗜水气单胞菌具有良好的杀灭性,且在黄鳝养殖中可安全使用。但其有效性易受有机物影响,故在水产养殖中推荐使用直接作用法来测定其有效杀菌质量浓度。     

大鲵细胞与大鲵虹彩病毒的微载体规模化培养工艺及优化

利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。     

鲫细胞与病毒微载体规模化培养工艺研究

本文研究了在Cephodex微载体悬浮培养系统中规模化培养鲫脑组织细胞(Gi CB)和鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)的工艺。结果表明,Cephodex微载体适合GiCB细胞的贴壁培养,细胞贴壁期培养基中血清浓度为10%,微载体浓度为6 g/L;细胞初始接种密度为2.5×10~5cells/m L时,以转速35 r/min,每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌条件贴壁率最佳,8 h后贴壁率可达90%以上;增殖期以45 r/min的连续搅拌速度可获得最佳的细胞生长效能。采用优化的工艺条件,以感染复数为0.2的CyHV-2病毒接种规模化培养的GiCB细胞5 d后,出现典型的细胞病变效应,病毒滴度(TCID_(50)/m L)可达10~(6.50±0.30)。本项研究为鲫造血器官坏死症疫苗的规模化制备技术研究奠定了前期基础。     

患病大鲵摩氏摩根菌的分离与鉴定

从患病大鲵肝脏中分离到1株优势菌SX01,通过Biolog微生物自动鉴定系统、16S rDNA序列分析及构建系统发育树的方法对纯培养的细菌进行鉴定,并进行人工感染试验及药敏试验。结果表明,该分离菌为摩氏摩根菌(Morganella morganii),对大鲵具有致病性。药物敏感性试验表明,该菌株对头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南等10种药物高度敏感。     

利用RIL群体分析HMW-GS对小麦品质性状的量化效应

利用重组自交系群体——RIL-8群体的131个系及其亲本为材料,分析了高分子量麦谷蛋白亚基及亚基组合对10个小麦品质性状的量化效应及其差异。结果表明,RIL-8群体Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点编码的亚基分别为 1、N,7+9、7+8和5+10、2+12,主要存在7种亚基组合类型。同一位点不同亚基对面粉吸水率、Zeleny沉淀值、面团形成时     

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR 检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒.经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法.检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.9991,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107 copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号.取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104 copies/μL和3.02×102 copies/μL.本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义.     

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果

为了研究嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt,1869)后的免疫应答反应与保护效果,本研究采用福尔马林灭活法制备嗜水气单胞菌灭活疫苗。通过腹腔注射途径免疫健康施氏鲟,对施氏鲟外周血的红细胞和白细胞数量、白细胞组成、吞噬活性、吞噬指数、血清酸性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清中和抗体效价等免疫指标及疫苗保护效果进行测定。结果显示,免疫组红、白细胞数量迅速上升,于免疫后第4天达峰值,分别为(8.50±0.17)×10~8个/mL和(8.96±0.44)×10~6个/mL;单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比于第7天达峰值,分别为10.50%和15.53%,极显著高于对照组(P0.01),淋巴细胞分类百分比在第21天才达峰值73.51%;吞噬指数和吞噬百分比均于第4天达到最高值,分别为4.53和30%;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性分别在免疫后第7天和第14天达到峰值,极显著高于对照组(P0.01);血清抗体效价于免疫后第21天达到峰值1:203,极显著高于对照组(P0.01)。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为76.84%。由此可见,嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后,能够显著诱导施氏鲟体内的免疫应答反应,增强鱼体的免疫保护能力。本研究为养殖鲟因嗜水气单胞菌感染引起疾病的免疫预防技术研究奠定了前期基础。     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。