牛病毒性腹泻病毒反转录及3'-末端克隆测序方法研究

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科瘟病毒属代表种,其基因组为单股正链RNA,无Poly(A)尾。传统的3'-末端快速扩增方法不适用于牛病毒性腹泻病毒的3'-末端克隆测序。本研究根据牛病毒性腹泻病毒基因组3'-末端共有特征碱基,设计回文锚定引物CGend。以BVDVJZ05-1毒株为研究对象,进行了反转录及3'-末端克隆测序。结果表明,CGend的反转录效果优于随机引物和一般特异性下游引物,并且扩增得到了JZ05-1的3'-末端完整序列。本研究为瘟病毒属病毒反转录和3'-末端克隆测序提供了新思路。     

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。     

CFNCpG对BVDV1灭活抗原的免疫佐剂效应研究

分别用CFNCpG、弗氏完全佐剂、氢氧化铝胶与BVDV1灭活抗原配制成疫苗免疫家兔,于免疫后每间隔7d检测中和抗体变化,来探讨CFNCpG对BVDV1灭活抗原的佐剂效应。试验结果表明,CFNCpG单独作为佐剂应用7d可使抗体滴度达到4.4(log_2SN_(50)),14d可达到7.0以上;与氢氧化铝胶联合可使抗体滴度在21d达到7.0以上,其佐剂水平与弗氏完全佐剂相当。有望进—步研制成为BVDV1灭活疫苗佐剂成分。     

牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1基础毒株的安全性和免疫原性研究

本试验用已分离到的牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1基础毒株对犊牛免疫的安全性和免疫原性进行了研究。通过对基础毒种单剂量、超剂量、单剂量重复安全试验和免疫原性试验研究证实,BVDV2/JZ05-1对犊牛免疫是安全的,对犊牛感染BVDV有很好的免疫保护效果。     

鹿源牛病毒性腹泻病毒JZ05-4株的分型鉴定

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV) JZ05-4毒株生物型、基因型及遗传背景,本研究将其在MDBK细胞上进行传代培养并观察细胞培养特性,利用荧光抗体染色和RT-PCR的方法对其进行基因型鉴定研究.试验结果证明,BVDV/JZ05-4毒株为CPE生物型、BVDV-2基因型.     

牛病毒性腹泻病二价弱毒活疫苗制备工艺研究

研究了BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3二价弱毒活疫苗的制备工艺。通过对BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒传代培养测定毒价后,试制出5批毒价分别是105.4TCID50/mL和105.6TCID50/mL的BVDV二价弱毒活疫苗,经检验符合试验设计要求。     

结核分枝杆菌DNA的快速提取试验

在革兰氏阴性杆菌DNA快速提取方法的基础上，结合结核分枝杆菌特点，对结核分枝杆菌DNA的快速提取进行了试验研究，初步建立了一种结核分枝杆菌DNA的快速提取方法。该方法为结核分枝杆菌病分子生物学快速诊断及其基因的克隆提供了技术支持。     

牛分支杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析

从患结核病鹿的肺组织中粗分离牛分支杆菌制备DNA模板,用PCR对牛分支杆菌ESAT-6基因进行了扩增,将扩增的产物连接于测序载体pGEM-TE上克隆,经测序确定无误;并使用分子生物学软件对ESAT-6基因进行了分析。结果显示:ESAT-6基因编码的蛋白有较好的抗原性;ESAT-6基因在结核分支杆菌和牛分支杆菌各基因型中具有高度保守性。本研究为下—步研制重组标记疫苗奠定了基础。     

牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化

本研究拟构建牛型结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达载体,并纯化得到目的蛋白。将牛型结核分枝杆菌ESAT-6的PCR扩增产物连接到p NC-His E载体,构建ESAT6-p NC-His E重组质粒。将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定为阳性;将该阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于培养基中,不需诱导即可分泌表达,离心取上清,并对上清进行纯化、检测,得到目的蛋白。本研究提供一种可快速、简便地获得大量枯草芽孢杆菌分泌性表达ESAT-6蛋白的方法。     

节瘤拟杆菌K-凝集试验方法的建立

根据节瘤拟杆菌(D.nodosus)特异的表面抗原———K抗原具有凝集反应的特性,建立了检测抗节瘤拟杆菌抗体的方法———K-凝集试验方法。节瘤拟杆菌液体培养物接种兔,制备节瘤拟杆菌阳性血清;福尔马林灭活肉汤培养物制备抗原,结果表明,该方法使用方便、特异性强。