利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增.结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299 bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号.与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌.     

西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因pilO及pilQ的功能分析

瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种病害,其病原为噬酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli),自报道以来已给美国、澳大利亚、巴西、中国等众多国家的瓜类作物种植业造成了严重的损失。要从根本上防治瓜类细菌性果斑病,我们应弄清其致病机制。本实验对西瓜噬酸菌(A.citrulli)中部分Ⅳ型菌毛(pili)相关基因构建插入突变体,用浸种测定法筛选出两株致病力和发病率明显减弱的突变体,鉴定为pilO及pilQ基因突变体,并对这两株突变体的相关表型进行测定。在透射电子显微镜下观测发现,野生型及pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛,而pilQ基因突变体丧失形成Ⅳ型菌毛的能力;光学显微镜下观测野生型、突变体及互补菌株的颤动能力发现,pilO及pilQ基因突变体与野生型相比,完全丧失颤动能力;同时pilO及pilQ基因突变体游动能力、生物膜形成能力也明显减弱。互补菌株中,颤动能力得到恢复,致病力、游动能力以及生物膜形成能力部分恢复。在MMX基本培养基中测定野生型与突变体的生长曲线发现,突变体菌株生长能力无明显改变;同时突变体也能激发非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应。pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛但丧失部分Ⅳ型菌毛介导的功能,由此表明,pilO基因并不直接参与西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛的合成,而是Ⅳ型菌毛的功能基因;pilQ基因突变体不能形成Ⅳ型菌毛且丧失其介导的部分功能表明,pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接参与Ⅳ型菌毛的合成,是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因。同时也进一步证明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与其颤动性、致病性、游动性及生物膜形成能力相关。     

西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)营养缺陷型与致病性相关

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的一种病害,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产.迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少.本实验以西瓜噬酸菌xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,以哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)为实验材料,通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体,而后利用同源重组的方法获得插入突变体,并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定.研究结果表明,通过文库筛选得到的1株致病力明显下降的突变体,亚克隆鉴定可知该突变体△xj-25的Mini-Tn5插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ基因),其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称VB6)生物合成蛋白相关.突变菌株△Pdx.J致病性显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成鞭毛和产生生物膜.通过外源添加VB6可恢复其致病性和生长能力等主要表型.本研究证明VB6生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用,为降低病原菌侵害提供了一个新的思路.     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

产酶溶杆菌OH11菌株α-水解蛋白酶基因的克隆与表达

α-水解蛋白酶是产酶溶杆菌OH11菌株分泌的一种胞外丝氨酸蛋白酶。利用PCR方法从OH11菌株中克隆到该基因。同源性比较其推测产物与产酶溶杆菌ATCC29478菌株和ATCC29487菌株的α-水解蛋白酶有90%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET30a( )上构建重组质粒pαLP,并转化宿主菌BL21(DE3)获得BLαLP表达菌株。经IPTG诱导后发现BLαLP菌株产生一相对分子量约为44kD的蛋白。研究表明,该蛋白能将蛋白质水解,在脱脂奶粉培养基上形成水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。     

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

 根据梨火疫病菌16S~23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBR Green I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。     

拮抗细菌菌株Pseudomonas fluorescens 7-14在水稻植株上的时间、空间定殖型

 Pseudomonas fluorescens 7-14(Pf 7-14)是一株对水稻纹枯病、稻瘟病和恶苗病有拮抗作用的细菌菌株。在温室条件下,在水稻孕穗后期喷雾浓度为1×10¹⁰cfu/mL的菌株Pf 7-14悬浮液,采用定期取样,用稀释平板法回收细菌,并通过图形测试和ShapiroWilk正态测试,测定了该菌株在水稻剑叶和茎基部的时间、空间定殖型。结果表明,菌株Pf 7-14在稻株上的定殖型随着时间的变化而改变。从定殖的空间上看,无论是在剑叶还是在茎基部,其定殖型可划分为3种类型或3个阶段,从最初的正态分布、之后的对数分布,发展到后期的不规则分布。对每一种分布型来说,菌株Pf 7-14在稻茎基部持续的时间比其在稻剑叶上长。在剑叶上,这3种分布型持续的时间分别是2 h、7 d和10 d,而在茎基部分别是1、24 d和大于11 d (至收获期)。从定殖的时间和数量关系上看,在剑叶上,菌株Pf 7-14的平均群体在24 h内下降了90%以上,在7 d内下降了99%,在19 d下降到检测不到的水平。而在稻茎基部,在24 h内下降小于30%,在7 d内下降了大约60%,在35 d内,部分样品中仍能检测到其群体。这些结果表明菌株Pf 7-14在茎基部比在叶片上更稳定,定殖的时间更长,这也很可能表明叶部病害(如稻瘟病)的生物防治将比茎部病害(如纹枯病)更为困难。     

新疆伊犁地区甜菜上发生两种新病害

甜菜是新疆主要经济作物之一,在调查甜菜病害中发现两种新病害,经检索及专家咨询,认为是我国新记录种,现报道如下。１甜菜紫纹羽病此病学名为Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉ－ｕｍｐｕｒｐｕｒｅｕｍＰａｔ．（无性世代为ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｃｒｏｃｏｒｕｍＦｒ．）由...     

中国南方水稻条斑病菌小种分化研究

采用针刺接种的方法,在水稻孕穗期的剑叶上接种测定了国内南方稻区细菌性条斑病菌62个菌株的致病力。根据病菌与鉴别品种互作反应和亲和性的差异,将供试条斑病菌株区分为6个小种。大多数条斑病菌株与鉴别品种的互作反应表现为弱互作模式,部分菌株与品种间存在强互作关系.