氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

喹乙醇人工抗原的合成与鉴定

采用琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),以质谱法对其进行鉴定;活化酯法合成全抗原OLA-BSA、OLA-OVA,以紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定之;用OLA-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性、特异性。紫外扫描测得OLA-BSA、OLA-OVA中OLA-HS和BSA、OVA的分子结合比分别为17.1∶1和12.4∶1;3号小鼠抗血清的效价最高,对OLA的IC50为58.923 ng/mL,与卡巴氧的交叉反应率为1.841%,与其他药物无交叉反应。通过系列ELISA鉴定,获得高价、敏感、特异的多克隆抗体(pAb),为OLA残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

种子发芽试验存在的问题及对策

在种子的收购、调运、安全贮藏过程中和销售前,各种子企业通过发芽试验来测定种子批的最大发芽潜力。据此估测其田间播种价值．使栽培的优良品种获得优质、高产．避免不合格的种子用于生产所带来的损失。但在发芽试验中．由于环节较多、重复性强．检验者常常感到枯燥,机械性操作、生搬硬套、不注重细节,这样就会导致试验结果与实际情况产生偏差。给科研和生产造成不必要的损失和浪费。     

湿态玉米酒精糟（WDGS）利用的前景

玉米酒精糟是酒精厂生产酒精时的副产品,属于蛋白质饲料。目前大多是烘干后利用,不但能耗巨大,同时营养价值也降低许多。在美国,大约60％的玉米酒精糟是干态的DDGS,主要用于国内消费及出口;其他40％是湿态玉米酒精糟,主要在酒精厂附近地区用作草食家畜的饲料。我国生产和消费的玉米酒精糟绝大多数是干态的玉米酒精糟,湿态玉米酒精糟的市场潜力巨大。阐述干态和湿态玉米酒精糟的生产工艺、营养成分、饲喂价值及用途．并分析了湿态玉米酒精糟的利用现状及前景。     

喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定

通过质谱法鉴定合成喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-HS),紫外法及凝胶电泳法鉴定全抗原OLA-BSA和OLA-OVA后,使用杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体(OLA mAb),对其效价、亲和力、敏感性、特异性及亚型进行鉴定,并通过体内诱生腹水法进行大量制备。试验结果表明,本研究成功制备了OLA-HS,且半抗原与载体蛋白偶联成功;筛选出的5株杂交瘤细胞单抗同种型均为IgG1,细胞培养上清间接ELISA效价在1∶3.0×102～1∶1.28×103之间,用4E12细胞株制作的腹水效价为1∶5.12×105。OLAmAb亲和常数Ka为3.75×1010L/mol,对OLA的IC50为1.51ng/ml,且具有较好的特异性。试验获得了高效价、敏感、特异的OLA mAb,可用于动物性食品中OLA残留检测的免疫学试验。     

猪氨基酸转运载体b0,+AT-2的分子克隆及其序列分析

本研究克隆了b0,＋AT-2的全长cDNA序列。基于NCBI发布的人和鼠b0,＋AT序列,应用生物学软件进行序列比对后在同源区设计引物,获取cDNA片段;再利用RACE技术克隆了其全长cDNA序列。生物信息学分析显示：猪b0,＋AT-2的全长1 488 bp,包括90 bp的3′非翻译区（UTR）和126 bp的5′UTR;编码区（CDS）编码423个氨基酸残基,分别和人、鼠b0,＋AT以及猪b0,＋AT-1有75.1%、71.9%和86.6%的同源性。     

平菇基因组文库的构建

本文采用原生质体裂解法制备高分子量平菇总DNA。通过Sau3A部分酶切和蔗糖密度梯度离心,获得15～25Kb平菇总DNA酶切片段。并以Lambda的衍生物EMBL3为载体,酶连形成重组DNA。然后将其包装,转染受体菌LE392,在TB平板上获得2.5×10~4个重纽子克隆。此重组子克隆群即构成中蔬10号平菇菌株基因组文库。     

豫北太行山保存二十二种珍稀濒危植物

豫北太行山区,地处暖温针阔叶混交林带。地形为典型的喀斯特地貌,峭壁林立。峰峦叠翠。野生植物遍布峰顶、山腰、谷底。堪称为植物王国。据林业科技工作者两年时间的艰苦工作,初步查明有野生植物1000余种。其中珍稀濒危植物有22种。在科学研究,园林花卉和药物医疗等方面。都有较高的价值。     

G—P复合生物杀虫剂防治麦蚜和菜蚜的研究

利用Ｇ－Ｐ杀虫剂——灰绿拟青霉发酵液与两种植物提取物配制的复合生物杀虫剂防治麦蚜和菜蚜，室内毒力测定结果表明：Ｇ－Ｐ杀虫剂４００倍液４８小时对３种麦蚜的毒效为９８．４％～９８．９％，对３种菜蚜的毒效为９２．７％～９８．３％；Ｇ－Ｐ杀虫剂对６种供试蚜虫的致死中浓度为稀释１５３６～２０７５倍。田间小区试验和大田示范Ｇ－Ｐ２００和４００倍液对麦蚜与菜蚜２天防效均达９５％。