Vero细胞中禽呼肠孤病毒的增殖特性研究

为了研究绿猴肾(Vero)细胞中禽呼肠孤病毒(ARV)的增殖特性,试验采用了光学显微镜观察、半数组织感染量(TCID50)测定、RT-PCR检测等方法对细胞培养物进行了研究。结果表明:ARV S1133毒株在Vero细胞中能有效增殖,并出现细胞破碎、萎缩、抱团、脱落、边缘模糊、胞体变大,甚至死亡等典型的细胞病变(CPE);RT-PCR检测成功扩增出一条大小为1 248 bp的条带;ARV在感染Vero细胞后会经历三个时期,即潜伏期、快速增长期、稳定期,并在稳定期病毒效价达到峰值,TCID50为1×10~(-8.46)/0.1 m L。     

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒（CSFV）及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据GenBank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性（翠绿色）,其他非CSFV样本的检测结果均为阴性（桔红色）,且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。     

猪蓝耳病病毒RT-LAMP快速可视化检测方法的建立

为建立能快速检测猪蓝耳病病毒（PRRSV）的检测方法,本研究根据基因库中PRRSV非结构蛋白NSP2基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增（RT-LAMP）引物,建立了PRRSV的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 copies RNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在50 min内完成;可通过肉眼观察钙黄绿素（calcein）颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性,同时应用实时浊度仪对反应体系浊度及浊度的变化速率进行实时测量,结果相一致。结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于PRRSV感染的快速检测。     

转基因烟草中外源基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析.     

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒（AIV）的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型（723 bp）和N2亚型（314 bp）AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。     

禽流感病毒 H9和 N2基因双重 RT-PCR 方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立

用兔抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)多抗作为包被抗体,BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体,建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法,对各项反应条件进行优化,最终获得最佳工作条件为兔多抗1∶1 600稀释包被,NS3单抗1∶2 000稀释,酶标抗体工作浓度为1∶4 000稀释。特异性和敏感性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无特异性交叉反应,其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量,与RT-PCR方法的相比较,符合率为100%。所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感,可用于BVDV抗原的检测。     

一株鸭源基因IX型新城疫病毒广西分离株的生物学特性及全基因序列分析

为全面了解广西分离株GX19／2011的生物学和遗传特性,对分离株的鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）、6周龄鸡胚静脉接种致病指数（IVPI）和对鸭的致病力进行测定,并对其全基因遗传特性进行研究研究。结果显示：该分离株的ELD50为10-9.48/0．1mL、MDT为51．4h、ICPI为1．80、IVPI为2．82。使用该毒株分别感染35日龄和50日龄的鸭,发病率均为100％,死亡率分别为100％,70％。该毒株全长为15192bp,与F48E8和GD09-2等参考毒株的亲缘关系较近,均属于基因IX型。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为11R-R-Q-R-R-F117,具有强毒株的典型特征。生物学特性和遗传进化分析结果都表明该毒株为速发型强毒株,同时对鸭具有较强的致病力。     

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析

为调查禽腺病毒的感染状况,2008—2010年从广西南宁市活禽市场采集样品259份,通过SPF鸡胚传代增殖,经PCR鉴定,92份为禽腺病毒阳性,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株进行免疫琼脂扩散、血凝性、致细胞病变、形态学和鸡胚致病性试验。结果:8株均与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应,不能凝集鸡红细胞,病毒粒子具有腺病毒典型特征,可致鸡胚肝细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。将克隆的8株hexon基因进行序列比对及遗传进化分析,显示均与Ⅰ群禽腺病毒同源性最高,亲缘关系最近。结果表明,8株分离株均为Ⅰ群禽腺病毒。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。