实时荧光定量PCR技术及其在水生动物病毒病定量检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因的方法,其最早的应用报道是Saiki等[1]1985年应用于β-珠蛋白基因的扩增和镰状细胞性贫血的诊断分析.     

斑点叉尾鮰柱形病病原的分离鉴定及药敏试验

从网箱患柱形病的斑点叉尾鮰病灶中分离到一株细菌(YZ130310),经回归感染试验证实其具有高度致死性.经形态学观察、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定,其主要特征为:革兰氏阴性,菌体细长、两端钝圆、弯曲或直的杆状,菌落浅黄色,边缘不整齐呈根须状;氧化酶、过氧化氢酶阳性,分解酪素和明胶,不分解纤维素、几丁质、酪氨酸、七叶灵和淀粉,硝酸盐还原阳性,吲哚和葡萄糖产气阴性.菌株的16S rRNA基因序列分析结果表明,菌株YZ130310与GenBank上登录的柱状黄杆菌(Flavobacterium Columnare)ATCC 49512株的16S rRNA序列同源性最高,其相似性达99.6％;在基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树中,菌株YZ130310与柱状黄杆菌(AY095342)聚为一支.综合形态及生理生化特点和分子生物学的分类鉴定结果,菌株YZ130310可鉴定为柱状黄杆菌(F Columnare).16种抗菌药物的敏感性试验结果表明,菌株YZ130310对头孢哌酮等7种药物敏感,对阿米卡星和氧氟沙星2种药物中度敏感,对头孢氨苄等7种药物存在不同程度的耐药性.     

一例黄沙鳖红脖子病的病原菌鉴定与防治

从患红脖子病黄沙鳖的肝脏、肺脏分离到一株细菌,人工感染黄沙鳖证实为该病的病原菌。对该菌的形态特征、生理生化进行分析和双重PCR鉴定,确定为携带气溶素(aer)基因的致病性嗜水气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌对头孢哌酮、氧氟沙星、恩诺沙星3种药物敏感;选用头孢哌酮和恩诺沙星对该病进行防治,获得较好的治疗和控制效果。     

水杨酸对铜绿微囊藻的化感抑制作用

[目的]探讨外源水杨酸对铜绿微囊藻生长及光合系统的影响,为将水杨酸应用于除藻剂研发提供参考依据.[方法]通过人工[培养的方法,利用分光光度计和各类试剂及试剂盒等对经不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L)水杨酸处理铜绿微囊藻的各指标进行测定,包括生长抑制率、叶绿素a、藻胆蛋白及总可溶性蛋白含量.[结果]水杨酸浓度越高,对铜绿微囊藻的抑制作用越明显,以0.12 g/L水杨酸的抑制率最高,且抑制作用随时间的延长而不断增强,48h后抑制率达95.66%.经0.10 g/L水杨酸处理后,铜绿微囊藻的叶绿素a、藻胆蛋白及总可溶性蛋白含量基本维持在初始水平;0.12 g/L水杨酸能有效抑制铜绿微囊藻的叶绿素a含量,促使铜绿微囊藻中的藻蓝蛋白(PC)含量相对降低、别藻蓝蛋白(APC)含量相对上升,但藻红蛋白(PE)含量基本维持在初始水平.[结论]水杨酸通过抑制铜绿微囊藻的叶绿素a等光合色素,阻遏其对光的捕获及吸收,扰乱藻胆蛋白各组分构成,从而致使藻类生长受抑,甚至死亡.即藻类叶绿素a是水杨酸抑制铜绿微囊藻生长的一个作用位点.     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

[目的]建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术.[方法]根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性.[结果]TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101~1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%~1.75%,组间变异系数为0.81%~1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高.[结论]利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测.     

广西海水养殖贝类腹泻性贝类毒素(DSP)检测及评价

为了解广西沿海贝类养殖中污染腹泻性贝类毒素的情况,于2007年和2008年对广西沿海钦州和防城海域采集的近江牡蛎、北海海域采集的文蛤,进行了腹泻性贝类毒素(DSP)含量检测.检测结果表明:2007年检测24个近江牡蛎样品中,DSP检出9个,检出率为37.5%,14个文蛤样品中DSP检出2个,检出率为14.3%;2008年采集近江牡蛎50个样品中,15个样品检出DSP,检出率为30%,27个文蛤样品,10个样品检出DSP,检出率为37%.根据检测结果提出了DSP贝类污染和DSP中毒的预防措施.     

白斑综合征病毒广西株缺失区基因的比较分析

为了解广西养殖凡纳滨对虾中白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的感染流行情况,并探讨WSSV广西株缺失区ORF23/24基因的遗传进化差异及其与各地WSSV毒株间的遗传进化关系,2010年5月至2013年9月在广西凡纳滨对虾主产区北海、钦州和防城港共采集306份患病虾样品,应用世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式聚合酶链式反应(nested-PCR)方法进行WSSV检测;选取第一轮PCR为阳性的53份样品进行缺失区ORF23/24基因的PCR扩增,并将12份阳性PCR产物进行克隆、序列测定与比较分析。结果显示:306份患病虾样品中有82份为WSSV感染阳性,阳性率为26.8%;12株WSSV广西株缺失区ORF23/24基因大小均为2 096 bp,相对于此区域最为完整的WSSV-TW株,广西株均在中间缺失了10 970 bp;12株WSSV广西株的缺失区ORF23/24基因差异小,核苷酸同源性均在99.6%以上,仅存在少数碱基的替换,没有缺失和插入,其中BH-3、QZ-1、FCG-1和FCG-2的核苷酸序列完全一致;基于缺失区构建的系统发育进化树显示,WSSV广西地方株在遗传上相距较近,全部与印度株IN-05-Ⅰ聚在一个大的分支,而与台湾株、中国株及韩国株在遗传上相距较远。研究表明,WSSV感染在广西凡纳滨对虾主要养殖地区存在一定程度的流行;广西WSSV毒株缺失区ORF23/24基因的变异类型为中间大片段缺失,各毒株间无明显的地域和时间差异;WSSV广西株与印度株IN-05-Ⅰ的遗传进化关系最近。     

PAN-S 负载纤维富集-ICP-MS 法测定畜禽饮用水中痕量铬

为提高畜禽饮用水中痕量铬的测定灵敏度及降低检出限,采用螯合剂1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚-6-磺酸（PAN-S）处理聚丙烯基强碱性阴离子交换纤维,制得 PAN-S 负载纤维;用 PAN-S 负载纤维富集畜禽饮用水中痕量铬,然后用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定,建立 PAN-S 负载纤维富集—ICP-MS 法测定畜禽饮用水中痕量铬的方法。结果表明：当待富集液体积小于1000 mL、pH 6、上柱流速小于15 mL/min时,铬可被有效富集,且富集不受 K＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋等共存离子的干扰;用0．2 mol/L 硝酸10 mL 能完全洗脱,洗脱液能满足 ICP-MS 法测定的要求;该方法的回收率为90．0％～96．0％,相对标准偏差（RSD）在1．0％～2．2％,检出限为0．02μg/L;应用优化的富集测定方法和常规的二苯碳酰二肼分光光度法同时对30份畜禽饮用水样品进行痕量铬的检测,两种方法的测定结果基本一致,说明优化的富集测定方法可应用于畜禽饮用水中痕量铬的检测。     

黄喉拟水龟致病菌——松鼠葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

从患病的黄喉拟水龟Mauremys mutica肝、肾中分离得到一株革兰氏阳性菌株,经人工感染试验证实,该菌为致病菌。对该菌的生理生化指标进行了分析,结果表明：该菌具有氧化酶、触酶、葡萄糖呈阳性,凝固酶、鸟氨酸脱羧酶、密二糖呈阴性,M—R为阳性,VP反应为阴性等特征,与报道的松鼠葡萄球菌特征一致。采用BIOLOG自动微生物鉴定系统对该菌进行鉴定,将适当浊度的细菌悬液接种GP2板条培养16—24h后读出结果,并将结果输入计算机,经Biolog Microlog24．2软件分析鉴定,结果显示为松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri,可能性为99％,相似性和位距分别为0．913和1．30。结合形态和生理生化特点,将其鉴定为松鼠葡萄球菌。纸片扩散法药敏试验结果表明,该菌仅对头孢拉定和阿米卡星敏感,对头孢哌酮中度敏感,对其他抗生素均存在不同程度的耐药性。     

鱼类寄生虫病的检测与诊断程序及其应用

借鉴GB18448-2001和GB14922.1-2001,参考国内外实验动物寄生虫学质量控制的有关文献资料,结合实际检测中积累的大量实验数据和相关经验,对鱼类寄生虫病的检测和诊断技术进行了整理归纳,总结出科学合理、操作性强,检出率高的检测及诊断程序,为防治和控制鱼类寄生虫病提供科学依据.