非洲猪瘟病毒D250R蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】分析非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus,ASFV） D250R蛋白潜在的生物学功能,制备其多克隆抗体,为ASFV D250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等。通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白,Western blotting检测纯化蛋白的反应原性,将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析结果显示,D250R蛋白共由250个氨基酸组成,理论分子质量为29 822.54 u,理论等电点为8.96,为亲水性蛋白,无信号肽及跨膜区。修饰位点预测结果显示,D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点,其中丝氨酸（Ser）6个、酪氨酸（Tyr）6个、苏氨酸（Thr）3个;2个N-糖基化修饰位点,分别位于第61和197位氨基酸处。生物学功能预测结果显示,D250R蛋白含有Nudix序列,具有解水解酶活性。蛋白结构预测结果显示,D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20%、7.60%、15.20%和28.00%,三维空间结构存在较多α-螺旋,与二级结构预测结果基本一致。将ASFV D250R基因克隆至pET-32a （＋）获得pET-32a-D250R重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下,D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达,蛋白大小约44 ku,蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白;Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA检测结果显示,D250R蛋白抗体效价达到1：256 000,成功制备多克隆抗体;IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究在分子层面分析了D250R蛋白的理化性质及蛋白结构,在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达,纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性,为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础。     

薄层扫描测定5种疯草中苦马豆素含量

称取甘肃棘豆粉200g，变异黄芪粉200g，茎直黄芪粉171g，毛瓣棘豆粉174g，冰川棘豆粉200g，甲醇渗漉，回收甲醇，浸膏用1mol/L HCl溶解，过阳离子交换柱，洗脱液75℃水浴挥干，残留物先用甲醇溶解，回收甲醇后再用氨性氯仿溶解，回收氯仿，分别得到总生物碱214、117．5、75．4、33．1、10．5mg。甲醇溶解总生物碱与苦马豆素标准品，定量点样于硅胶板，显色后薄层扫描得出甘萧棘豆、变异黄芪、茎直黄芪、毛瓣棘豆和冰川棘豆中苦马豆素的含量分别为0．106、0．030、0．053、0．032、0．020mg/g.     

苦马豆素对人食道癌Eca-109细胞体外生长的抑制试验

探讨苦马豆素 (SW)对人食道癌 Eca-10 9细胞生长的抑制作用 ,以揭示 SW治疗食道癌的作用机制。选用不同剂量的 SW与食道癌Eca- 10 9细胞共同培养不同时间后 ,用 MTT法观察 SW对食道癌 Eca- 10 9细胞生长的抑制作用 ;细胞 DNA经特异性荧光染色后 ,用流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 :SW对食道癌Eca- 10 9细胞生长的半数抑制浓度 IC50 <2 .5μg/ m L;细胞周期分析 ,Eca- 10 9细胞 G1期细胞增多 ,S期细胞减少。结果表明 :SW可通过抑制人食道癌 Eca- 10 9细胞系生长达到抑制肿瘤的目的。     

我国西部草原疯草危害调查

采用现场调查和资料收集相结合的方法。对我国疯草的种类、分布、危害及各地在疯草中毒防治方面的对策进行了调查研究。调查结果表明，我国有疯草44种（其中棘豆属23种。黄芪属21种），构成严重危害的有18种，分布面积超过1100万hm^2，给草地畜牧业生产造成极大危害。并就其防治提出几点体会与建议。     

马立克病肿瘤相关抗原间接ELISA检测方法的建立

用自制并纯化的马立克病肿瘤相关表面抗原（MATSA）免疫SPF级BALB／c小鼠制备阳性对照抗体，以SPF级BALB／c小鼠血清为阴性对照抗体，筛选间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。结果，包被液为0．1mol／L pH9．6的碳酸盐缓冲液，抗原包被浓度为4μg／mL，封闭液为含10g／LBSA的PBST，抗血清稀释比例为1：800，酶标抗体稀释比例为1：1200，酶标抗体作用时间为37℃温育45min，底物作用时问为37℃温育15min，终止液为2mol／LH2SO4，洗涤4次，每次1min为最佳反应条件。将建立的方法应用于MATSA单克隆抗体研制过程中阳性克隆的筛选，成功获得了MATSA的单克隆抗体，表明该优化条件为间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。     

烟叶挑选前置对烤烟可用性的影响

针对烟叶挑选存在的问题,提出了一种流程优化再造的方式,将烟叶挑选前置到由农民合作社专业化分级队伍来完成,由卷烟工业企业人员提前介入,在收购定级时指导完成配方模块的分选。研究表明,烟叶挑选前置模式与常规挑选模式相比较,挑选成本降低了40.22%,挑选后烟叶A类烟叶比例高、损耗低,A类烟化学成分变异系数小,挑选效果较好。烟叶挑选前置有利于增强工业企业质量导向,提高分级素质,增加农民收入,提高烟农对工业企业的认可度和满意度。     

基于植物表型复合参数体系的烤烟等级初分检测方法

为实现快速无损智能判定烤烟等级，基于植物表型复合参数体系设计了一款便携式烤烟等级快速检测仪，通过试验确定了37个与烤烟等级值具有显著或极显著相关的表型参数组成了烤烟等级特征复合参数体系，选取K-Means聚类法、系统聚类法、 CHAID决策树算法、BPNN算法作为烟叶判定模型的建模对比算法，从500株云烟87烟株中选取了6个等级的595片烟叶作为样本源，每个等级的50片烟叶y样本作为建模数据，其余的烟叶作为验证数据，结果表明：基于贝叶斯分类器算法的等级判定准确率为75.59%，高于企业所要求的烟农初分准确度标准（准确度≥60%）。基于表型复合参数体系的烟叶判定模型可用于构建便携式轻量化的烤烟等级检测仪，为后续开展不同生态区烤烟等级快速检验研究奠定了基础。