cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

Pi-ta+和Bchi基因双价表达载体构建及水稻的遗传转化

稻瘟病是水稻上最重要的病害之一.本研究所用Pi-ta+基因是一个来自景洪直立型紫秆普通野生稻的基因,该基因属于稀有的抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,具有抗稻瘟病的能力;几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质,破坏细胞新物质的沉积使病原体死亡.为获得抗稻瘟病的水稻新材料和进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的转基因水稻新品种,本研究采用一种新的方法构建了Pi-ta+和Bchi的双价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi,通过农杆菌介导法转入栽培稻品种云资粳41中,经过一定浓度的甘露糖筛选培养,分化得到的再生苗经氯酚红显色法和PCR检测,获得11棵转基因阳性植株,离体检测证明外源基因的导入增强了转基因水稻的稻瘟病抗性.     

转PinⅡ基因抗虫水稻后代的农艺性状研究

对转PinII基因抗虫水稻T0、T1、T2代群体的株高、穗长、穗总粒、结实率、千粒重以及田间虫害发生率进行了研究,从中选出有利用价值的广谱抗虫性增强的材料20份,同时获得了一些矮化和分蘖能力增强的材料,这些工作对水稻抗虫新品种选育以及水稻基因功能分析和基因分离克隆具有重要意义。     

一种水稻真空渗透转化装置及方法的研究

探究适用于水稻的真空渗透转化装置及方法,旨在解决目前水稻转基因效率低、转化体变异多、周期长等问题。以抽穗期的‘云资粳41号’幼穗作为受体,应用自制的水稻真空渗透装置对其短暂抽真空渗透浸染导入外源基因。本试验共计转化水稻30株,收获19860粒T0代种子。研究发现不同浓度除草剂对T0代种子的萌发影响不显著,但对T1代材料的生长发育却具有明显抑制作用,因此选择苗期喷施法进行抗性转化子筛选,最佳筛选浓度为20 mg/L。经除草剂抗性筛选,获得抗性苗135株。经PCR分子检测,最终获得阳性苗114株,表明外源DNA已成功导入到受体水稻基因组中。本研究首次应用真空渗透法快速实现了水稻外源基因的转化,为水稻及其他作物的基因转化提供了一种快速、有效的新装置和新途径。     

云南药用野生稻幼穗离体培养研究

药用野生稻由于结实率低、落粒性强,难以利用种子保存繁殖。为了进一步在育种中有效地利用药用野生稻抗虫、抗病、抗旱、分蘖力强等优良特性,本研究利用药用野生稻幼穗,通过离体培养方法获得植株再生苗。实验设计了10种不同生长调节剂浓度的愈伤诱导培养基,筛选出N6+2,4-D 2.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30 g/L、pH值5.8是最适合愈伤诱导的培养基;设计了10种分化培养基,筛选出N6+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 3.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30.0 g/L、pH值5.8最适合作分化的培养基。设计了10种生根培养基,1/2N6+NAA 0.2 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖15.0 g/L、pH值5.8最适合作生根培养基。研究发现用4℃低温对幼穗前处理,然后使用强弱光照交替进行预培养后再进行愈伤诱导,可获得较高的愈伤诱导率。     

云南省地方稻种资源研究进展

云南省具有丰富的地方稻种资源,合理地挖掘和利用地方稻种优异性状,有利于加快水稻育种效率,促进水稻产业的发展。从云南省地方稻种资源的收集与分类、农艺性状、遗传多样性、品质和抗性研究等方面进行综述,为更深入研究和利用云南省地方稻种资源提供理论参考。     

野生稻种子胚乳蛋白的提取及双向电泳条件的确立

为揭示野生稻与栽培稻之问种子贮存的差异,建立了一套适合于水稻胚乳蛋白双向电泳分析的技术。探讨了种子胚乳蛋白的提取、纯化以及双向电泳的一些关键技术。结果表明,直接使用提取液（7M尿素,2M硫脲,4％3-[3-（胆酰氨丙基）二甲铵基]丙磺酸内盐,0．5％等电聚焦缓冲液3—10,40mM二硫苏糖醇）对单位米粉进行抽提后,直接离心上样,可以防止样品蛋白的丢失,保证样品蛋白的完整性,而在等电聚焦时,延长除盐时问,可以有效地减少凝胶中的横纹和竖纹,通过二向电泳分析结果,我们从合系41种子胚乳中得到蛋白斑点数约为310个,从滇超9号种子胚乳中得到蛋白点数约为327个,普通野生稻中得到蛋白点数约为331个,药用野生稻种子胚乳中得到蛋白点数约为346个,疣粒野生稻种子胚乳中得到蛋白点数约为278个。     

水稻氮高效利用的研究进展

氮肥在我国水稻种植中投入量巨大,但氮肥利用效率却远低于世界平均水平.这不仅消耗高额的成本,而且破坏生态.因此,选育氮高效水稻具有重要意义.主要针对高效氮水稻的氮素吸收利用效率、生理机制、提高水稻氮高效吸收的方法及水稻氮高效基因的挖掘等方面进行了综述,以期为今后更好地开展氮高效水稻农业育种研究工作提供科学依据.     

云南三种野生稻遗传多样性和系统进化研究

采用ISSR标记,对云南三种野生稻遗传多样性进行研究,并以竹类、栽培稻粳稻02428和籼稻金刚30以及非洲长雄野生稻为对照进行聚类分析,探讨云南三种野生稻遗传进化方向。结果表明,33条ISSR引物,在所有的材料中总共扩增出464个等位基因,平均每条引物扩增出多态性条带14.1条;从总体水平上看,云南三种野生稻具有丰富的遗传多样性,三种野生稻的多态位点数NP、多态位点百分率p、有效等位基因数Na、观察等位基因数Ne、Nei基因多样性指数H和香农指数I分别为357、76.74%、1.7694±0.4217、1.3391±0.3637、0.2037±0.1851和0.3180±0.2532;三种野生稻品种间基因分化系数Gst为0.5194,品种间的基因流Nm为0.4627,说明三种野生稻之间基因交流水平低,品种间存在较大的遗传分化。UPGMA聚类分析表明,在三种野生稻的进化过程中,疣粒野生稻分化最早,其次为药用野生稻,普通野生稻分化最晚。     

云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析

 根据已报道的NBS LRR类和STK类抗病基因结构中的氨基酸保守区域 ,设计简并引物 ,通过PCR扩增及克隆 ,从普通野生稻 (OryzarufipogonGriff.)、药用野生稻 (OryzaofficinalisWall.)、疣粒野生稻 (Oryzameye rianaBaill.)中共获得 14类NBS LRR类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 7类 ,药用野生稻中的有 2类 ,疣粒野生稻中的有 6类。药用野生稻中TO12代表序列与普通野生稻中TR19代表序列 ,同属一类 ,且具有 10 0 %的同源性 ,说明不同种野生稻中的同一类 (聚类 )抗病基因同源序列是完全一致的。同时 ,还获得 5类STK类抗病基因同源序列 ,其中普通野生稻中的有 4类 ;药用野生稻中的有 1类。通过氨基酸同源性比较分析 ,发现笔者克隆到的抗病基因同源序列与已克隆的抗病基因L6、N、Bs2、Prf、Pto、Lr10和Xa2 1等的氨基酸同源性都相当低 (均低于 2 5 % ) ,暗示了这些抗病基因同源序列可能是目前尚未报道的抗病基因的同源序列。