冷温血停搏液联合灌注对犬心肌氧自由基代谢的影响

为探讨含血停搏液不同灌注对心肌保护效应,将２８只低温体外循环犬随机分为４组：冷晶组（对照组,ｎ＝７）,低温体外循环冷晶停搏液间断灌注;冷血组（ｎ＝７）,低温体外循环１０℃冷血停搏液间断灌注;温血组（ｎ＝７）,低温体外循环冷晶停搏液诱导,开放前温血灌注;冷温血组（ｎ＝７）,低温体外循环２０℃冷血多次间断灌注与开放前温血联合灌注。从氧自由基损伤机制入手,于心肌缺血再灌注期不同时点抽取冠状静脉血样,测定血清丙二醛（ＭＤＡ）含量及血清超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性。结果显示,冷温血联合灌注组在主动脉开放１５ｍｉｎ至６０ｍｉｎ各时点,血清ＭＤＡ含量增加,ＳＯＤ、ＧＳＨ－Ｐｘ活性下降,与冷晶组、冷血组和温血组对应时点比较,增加和下降幅度均较小,差异显著（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）,提示２０℃冷血与３７℃温血停搏液联合灌注能获得最佳的心肌保护效果。     

慢病毒介导稳定表达禽β-防御素9的 DF-1细胞系的建立及初步应用

【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒,并将其感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选和纯化,获得稳定表达AvBD9蛋白的DF-1细胞系。利用RT-PCR和Western blot验证AvBD9基因在DF-1中的转录和表达;将细胞培养上清液与耐药大肠杆菌混合培养,检测其抗菌效果,并用扫描电镜观察其对菌体的损伤情况。【结果】筛选出了稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,且AvBD9在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清使耐药大肠杆菌的存活率低于55%,电镜观察显示菌体皱缩,损伤严重。【结论】成功建立能够稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供了借鉴思路,为进一步开展AvBD9的抗菌研究提供依据。     

禽致病性大肠埃希菌及其PhoP/Q缺失株对鸡小肠内AvBD6的诱导表达

【目的】分析雏鸡感染禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)及其PhoP/Q缺失株后β-防御素6(AvBD6)在小肠内的分布和表达规律。【方法】将14日龄雏鸡随机分为对照组、APEC攻毒组和PhoP/Q缺失株攻毒组,其中对照组雏鸡腿肌注射生理盐水0.5mL/只,APEC和PhoP/Q缺失株攻毒组雏鸡腿肌分别接种相同剂量1×106 CFU/mL的菌液,分别于攻毒后0,6,12,24,36和48h采集各组鸡小肠样品,用荧光定量PCR(FQPCR)方法对各组织内AvBD6mRNA的表达量进行检测,同时采用免疫组化(IHC)技术对AvBD6蛋白分布进行观察。【结果】FQ-PCR结果显示,感染后24~48h,APEC攻毒组雏鸡十二指肠、空肠、回肠的AvBD6mRNA表达量显著高于对照组(P0.05),于48h达到峰值且显著高于0h(P0.05);在同一时间下,PhoP/Q缺失株攻毒组AvBD6mRNA的表达量显著高于APEC攻毒组(P0.05)。IHC结果显示,AvBD6主要分布于各小肠段的绒毛上皮细胞和肠腺部分。【结论】APEC能够诱导雏鸡肠道内AvBD6的表达,且PhoP/Q可能参与APEC调控AvBD6的抗感染作用。     

四环素类药物残留检测方法研究进展

四环素类(Tetracyclines,TCs)是由链霉菌产生的一类广谱抗生素,在化学结构上都属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物。四环素类可分为天然品和半合成品两大类,天然品由不同链霉菌的培养液中提取获得,有四环素(Tetracycline)、土霉素(Oxytetra-cycline)、金霉素(Chlortetracyline)和去甲金霉素。半合成品有多西环素(Doxycycline)、美他环素(Metacy-cline)和米诺环素(Minocycline)等。在畜禽生产中,四环素类药物被广泛作为药物添加剂,用于防治肠道感染、促生长和提高奶牛产奶量,同时也被广泛应用于水产养殖和养蜂中预防和治疗多种感染性疾…     

PRRSV安徽分离株NSP2和ORF7基因的克隆与序列分析

2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在NSP2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病,根据GenBank中登录的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp2基因缺失区和猪伪狂犬病病毒(PRV) gB基因保守区序列,分别设计并合成了2对特异性扩增引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时检测HP-PRRSV和PRV的双重PCR诊断方法.利用建立的双重PCR方法对30份临床可疑样品进行检测,并与商品化单项PCR试剂盒进行对比验证.结果表明,本试验建立的双重PCR方法具有较高的灵敏度和特异性,与商品化单项PCR试剂盒检测结果完全一致.因此,该双重PCR方法能够用于HP-PRRSV和PRV单项或混合感染的临床样品快速鉴别检测.     

安徽部分地区猪伪狂犬病PCR诊断及流行病学调查

针对安徽省部分地区猪伪狂犬病发病率较高,给全省的养猪业造成较大危害的状况,应用聚合酶链反应(PCR)对安徽省7个地区21个养猪场的187头疑似发病猪的血清进行伪狂犬病病毒(PRV)的检测,并对阳性猪的流行病学分布情况进行统计分析。结果显示,安徽省猪PRV平均阳性率为34.2%;其中安徽省南部地区PRV阳性率最高,北部地区最低,规模养殖场PRV阳性率明显低于散养户,其结果为安徽省猪伪狂犬病流行病学调查及防控提供参考资料。     

安徽三黄鸡β-防御素Gal-6cDNA基因片段的克隆与序列分析

根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。     

恩诺沙星在鸡肉组织中残留的ELISA检测方法研究

分别用N-羟基琥珀酰亚胺法和氯甲酸异丁酯法把恩诺沙星(ENR)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔得到ENR的多克隆抗体,建立了ENR间接竞争ELISA方法。结果表明:抗ENR血清效价达达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为Y=-0.2341X+0.1193(R2=0.9878),中值(IC50)为36 ng/mL,最低检测限(LOD)为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10~1000 ng/mL。批内变异系数为3.18%~7.64%,批间变异系数为9.69%~11.94%,鸡组织中的ENR的回收率为76.5%~89.42%。本试验建立的ELISA方法能够满足恩诺沙星兽药残留检测要求。     

ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌生物学特性及致病性的影响

大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响,为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建epaPQR基因缺失株和回复株,通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验,分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响;通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明,成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株,epaPQR基因缺失后,其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）;但epaPQR基因缺失后,其运动能力显著降低（P<0.05）,在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少,通过荧光定量PCR发现,鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05）,缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明,ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成,影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力,表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用,本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。