水牛和黄牛同种及种间显微授精(ICSI)的初步研究

试验探讨了水牛和黄牛同种及种间显微授精的可行性。体外成熟22~24 h的水牛和黄牛卵母细胞分别注入冷冻/解冻的尼里－拉菲水牛和利木赞黄牛精子,进行同种或种间的显微授精操作,构建的ICSI胚胎一部分培养到16~18 h固定染色检查原核形成情况,另外一部分胚胎培养2~9 d分别记录胚胎的分裂情况及囊胚发育情况。结果发现,水牛同种(水牛+水牛)和水牛异种(水牛+黄牛)显微授精胚胎的双原核率(47.73%和36.67%)、分裂率(68.00%和72.64%)和囊胚发育率(16.44%和22.39%)均无显著差异(P＞0.05);黄牛同种(黄牛+黄牛)和黄牛异种(黄牛+水牛)显微授精胚胎的双原核率(60.00%和45.28%)、分裂率(73.33%和71.31%)和囊胚发育率(28.57%和33.70%)亦无显著差异(P＞0.05)。以上结果表明:①水牛精子注射到黄牛卵子和黄牛精子注射到水牛卵子的种间授精胚胎均可以体外发育到囊胚阶段;②黄牛卵子无论同种和种间显微授精的效果均优于水牛卵子。     

BDNF和NGF对牛颗粒细胞体外生长的影响

在DMEM培养液中分别添加不同质量浓度的脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BD NF)和神经生长因子(Nerve growth factor,NGF),观察其对牛颗粒细胞体外生长的影响.结果显示:在DMEM中添加20μg/L的BDNF,可促进牛颗粒细胞的体外生长;在DMEM中添加5μg/L的NGF,可促进牛颗粒细胞的体外生长.结果表明,在DMEM培养液中添加一定质量浓度的NGF和BDNF可促进牛颗粒细胞的体外生长.     

不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响

本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因（ICSI—mediatedgenetransfer。ICSI．Tr）操作后,先用5ixmol／L的离子霉素（ionomycin,Ion）激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg／mL放线菌酮（cycloheximide,CHX）培养5h（CHX5h组）、10μg／mLCHX培养3h后再用2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养2h（CHX3h-DMAP2h组）或用培养液（CM）培养3h后再用2mmol／L6-DMAP培养2h（CM3h．DMAP2h组）。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h．DMAP2h组（66．7％比49．5％,p〈0．05;66．7％比40．0％,p〈0．01;22．2％比9．9％,p〈0．05）。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h．DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组（p〈0．05）,2原核（pronucleus,PN）百分率则显著提高（42．4％比23．8％,p〈0．05;44．6％比23．8％,p〈0．01）。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。     

供体核种类对水牛核移植效果的影响

采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。     

黄牛卵母细胞和早期胚胎组蛋白乙酰化转移酶1表达模式研究

为探讨卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰基转移酶(HAT1)的表达规律,研究应用实时定量PCR技术,检测了广西本地黄牛卵母细胞和附植前胚胎HAT1基因的表达情况。结果表明:HAT1基因在黄牛生发泡期(GV)卵母细胞、第2次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞、体外受精(IVF)胚胎2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为1.00、0.56、0.08、0.55、0.43和0.31,在孤雌激活(PA)胚胎的2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为0.55、0.55、0.48和0.46。HAT1在GV期相对表达量最高,在IVF胚胎中2～4细胞表达量最少(P<0.05)。由此可见,HAT1基因在黄牛卵母细胞成熟和早期胚胎阶段均有表达,GV期HAT1基因的表达最高,PA胚胎HAT1基因的表达较稳定。     

不同方法提取猪和牛卵母细胞和早期胚胎 total RNA的比较

研究以猪和牛GV期的卵母细胞和8细胞期胚胎作为研究对象,分别用QIAGEN RNeasy Micro Kit、无根RNAPrep Micro kit和华舜快速RNA(微量)提取试剂盒提取其中的total RNA,通过对total RNA的浓度和纯度的分析比较,找出较适宜的提取方法.结果显示,QIAGEN RNeasy Micro Kit 能更有效地从少量猪和牛卵母细胞和早期胚胎中提取高质量的total RNA.     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文)

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

哺乳动物细胞核移植目前存在的问题

简要概括哺乳动物细胞核移植技术的应用前景,详细综述其目前存在的问题,认为对待细胞核移植技术的发展,应该理性分析。