哺乳动物克隆电融合技术的影响因素

电融合技术是目前动物核移植的最佳融合方法。核移植的融合率直接影响着核移植的效率,是核移植技术的关键环节之一。本文将对哺乳动物细胞核移植中影响电融合效果的相关因素的研究作一综述,以便人们进一步了解电融合的影响因素,从而提高动物克隆的效率。     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

本研究用体外成熟42-46h的猪卵母细胞为核移植受体,猪颗粒细胞为核移植供体,对猪体细胞核移植的电融合参数进行了探讨。结果发现,当脉冲时间为40μs时,0．77kV／cm组的融合率（59．3％）明显高于1．54kV／cm组（38．6％,P〈0．05）,分裂率（77．8%）及桑椹胚／囊胚发育率（33．3％）显著高于2．31kV／cm组（52．2％,13．6％,P〈0．05）;当电场强度为0．77kV／cm时,20μs组的融合率（68．0％）明显高于30μs组和40μs组（42．7％和35．5％,P〈0．05）,分裂率（89．3％）明显高于脉冲时间为40μs组（60．5％）;当电场强度为0．77kV／cm,脉冲时间为20μs时,电脉冲1次的融合率（72．8％）明显高于电脉冲2次（56．0％,P〈0．05）,在直流电脉冲前是否施加交流电（1．0V）对融合率（70．0％vs76．0％）、分裂率（77．3％vs75．0％）以及胚胎发育率（17．3％vs18．4％）均无显著影响（P〉0.05）。 以上结果表明,在本所实验室条件下,猪体细胞核移植中的适宜电融合参数为：0．77kV／cm,20μs,电脉冲1次,这将为随后的猪体细胞核移植奠定了基础。     

不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响

本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因（ICSI—mediatedgenetransfer。ICSI．Tr）操作后,先用5ixmol／L的离子霉素（ionomycin,Ion）激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg／mL放线菌酮（cycloheximide,CHX）培养5h（CHX5h组）、10μg／mLCHX培养3h后再用2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养2h（CHX3h-DMAP2h组）或用培养液（CM）培养3h后再用2mmol／L6-DMAP培养2h（CM3h．DMAP2h组）。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h．DMAP2h组（66．7％比49．5％,p〈0．05;66．7％比40．0％,p〈0．01;22．2％比9．9％,p〈0．05）。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h．DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组（p〈0．05）,2原核（pronucleus,PN）百分率则显著提高（42．4％比23．8％,p〈0．05;44．6％比23．8％,p〈0．01）。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文)

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

卵泡细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了卵泡细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响。颗粒细胞及其单层细胞对卵母细胞成熟后的分裂率(分别为85.4%和89.4%,对照为88.5%)及囊胚发育率(分别为35.9%和41.2%,对照为37.1%)无明显影响(P>0.05),然颗粒细胞的条件液则使卵母细胞的分裂率(81.4%,对照为88.5%)明显降低(P<0.05)。加入5×10~6/mL 内膜细胞、内膜细胞的单层细胞或25%条件液到成熟培养系统中,卵母细胞的囊胚发育率均有所提高,分别为44.1%,42.6%及39.8%。进一步探讨应用内膜细胞条件液的几个问题发现:条件液在成熟液中的合适比例为50%,收集的适宜细胞培养阶段为3～4d;条件液制备前应加入10%的血清,不加促性腺激素。这些结果表明:内膜细胞可分泌一些有利于卵母细胞成熟的生长因子。这些生长因子分泌的质和量可能取决于内膜细胞的培养阶段、血清浓度及外源激素的种类。     

哺乳动物细胞核移植目前存在的问题

简要概括哺乳动物细胞核移植技术的应用前景,详细综述其目前存在的问题,认为对待细胞核移植技术的发展,应该理性分析。     

牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化“去透明带双半卵体细胞克隆牛技术”，探讨了生产应用的可能性。结果表明：(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核，去核率可高达95％以上；(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起，可大大提高电击融合效率；(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率；(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎，解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法；(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎，获得88．2％(2575／2920)卵裂率、41．6％(1215／2920)囊胚率、75．4％(916／1215)冻胚率，冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28．1％(48／171)。结果说明，本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。     

牛体外受精胚胎冷冻保存的研究

本研究在国内条件下对牛体外受精胚胎的冷冻保存进行了系统研究。胚胎在含 4 .0mol/ L乙二醇的 PBS中停留 15～ 2 0 min,对其随后孵化无明显影响 ( 72 .2 %比 82 .4 % ,P>0 .0 5) ;当乙二醇的浓度升高到 5.0 mol/ L和 6.0 mol/ L时 ,胚胎的孵化率明显下降 ( 2 5.0 %和3.2 % ,P<0 .0 1)。在胚胎的常规冷冻保存试验中 ,当冷冻液为 1.8mol/ L乙二醇加 0 .2 0 mol/ L蔗糖时 ,- 7℃植冰后缓慢降温到 - 30℃投液氮保存的胚胎冻后存活率 ( 86.3% )和孵化率 ( 72 .5% )明显高于 ( P<0 .0 5)缓慢降温到 - 2 5℃投液氮保存的胚胎冻后存活率 ( 57.1% )和孵化率( 35.7% ) ;当冷冻液不加蔗糖时 ,胚胎的冻后存活率明显下降 ( 60 .9% ,P<0 .0 5) ,且胚胎冻后无一孵化。在胚胎的超速冷冻保存试验中 (在 - 2 3℃平衡 30 min直接置液氮保存 ) ,冷冻在冷冻液为 3.0 mol/ L乙二醇加 0 .30 mol/ L蔗糖中的胚胎冻后存活率 ( 84 .0 % )和孵化率 ( 60 .6% )明显高于冷冻液为 2 .5mol/ L乙二醇加 0 .30 mol/ L蔗糖、 2 .0 mol/ L乙二醇加 0 .30 mol/ L蔗糖和2 .0 mol/ L乙二醇加 0 .2 3mol/ L蔗糖的胚胎冻后存活率 (分别为 59.0 % ,4 3.5%和 2 5.0 % ,P<0 .0 5)和孵化率 (分别为 4 5.5% ,30 .4 %和 0 % ,P<0 .0 5) ;7日龄胚胎的冻     

哺乳动物原始卵泡体外培养与激活调控研究进展

随着体外受精、克隆与转基因动物等基础研究快速发展,对卵母细胞的需求越来越多,科学家们不得不寻求能够获得大量优质卵母细胞的新途径。原始卵泡作为生长卵泡的来源,其初始容量影响哺乳动物的繁殖性能,是整个雌性生殖期中各阶段卵泡及卵子发育的源头。哺乳动物的卵巢在出生时由一定数量的卵泡组成,大多数原始卵泡处于休眠状态,只有极少数的原始卵泡被激活并进入生长卵泡池中。因此合理开发卵巢里尚未激活的原始卵泡对提高动物繁殖率、加速优良牛种的遗传改良、阐明动物卵泡发生的分子机理具有重要意义。本文将目前哺乳动物原始卵泡体外激活的国内外进展做一综述,为研究动物和人类卵泡激活的生物学过程提供理论基础。     

虾青素对猪卵母细胞体外成熟的影响

本研究旨在探讨虾青素(astaxanthin, Ast)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响,为进一步优化猪卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。首先,将GV期猪卵母细胞培养在添加有不同浓度虾青素(0,5,10,20,40μmol/L)的体外成熟液中,40～44 h后统计第一极体排出率。结果显示与对照组相比,各处理组卵母细胞的第一极体排出率均显著升高(P<0.05),其中10μmol/L处理组卵母细胞的第一极体排出率显著高于5,20,40μmol/L处理组(P<0.05)。随后对MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活处理,结果发现10μmol/L和20μmol/L处理组的卵裂率和囊胚发育率显著高于对照组(P<0.05),且10μmol/L处理组囊胚发育率显著高于20μmol/L处理组(P<0.05)。最后,检测虾青素处理后MⅡ期卵母细胞的活性氧水平、丙二醛及谷胱甘肽的含量,以及整个胚胎发育阶段中抗氧化酶相关基因SOD1和GPX4的表达变化,发现GV期卵母细胞经10μmol/L虾青素处理后,孤雌激活囊胚的细胞数极显著升高(P<0.01);而MⅡ期卵母细胞的活性氧水平...