水牛卵母细胞体外成熟及体外受精过程中的皮质颗粒变化

用异硫氰荧光素联接的小扁豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate-labelled Lens culinaris,FITC-LCA)标记不同体外成熟时间和不同体外受精时间的水牛卵母细胞的皮质颗粒,用激光共聚焦显微镜检测其分布情况.结果发现,皮质颗粒在水牛卵母细胞体外成熟培养前,70.1%卵母细胞的皮质颗粒呈现中间分布;培养24 h后,皮质颗粒皮层分布的卵母细胞达59.8%,分布形式由完全聚合向完全分散逐步转变.对不同体外成熟时间的卵母细胞进行体外受精时发现,体外成熟12 h的卵母细胞仅在受精后3 h有12.9%的皮质颗粒外排.随着成熟时间的增加,皮质颗粒的排放也趋于明显,成熟24 h的卵母细胞受精后3 h皮质颗粒外排率可达100%.结果表明,在水牛卵母细胞的成熟过程中,皮质颗粒的分布由中间分布逐渐向皮层分布转变,最后在卵母细胞的质膜下排列成单层;体外受精过程中卵母细胞皮质颗粒的排放速度取决于其在卵母细胞中的分布情况,故而与体外成熟时间呈正相关.     

慢病毒介导多短发卡RNA串联载体构建与体内外抗口蹄疫效果评估

【目的】探讨应用多短发卡RNA(shRNA)串联沉默口蹄疫病毒RNA复制的可行性.【方法】针对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease,FMDV)非结构蛋白基因3B和3D保守区域设计合成3个shRNA的串联片段,并分别用3个不同序列的启动子引导,成功构建了3shRNA串联的慢病毒RNAi载体.利用慢病毒3质粒包装系统共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒.利用包装的慢病毒处理细胞及乳鼠,并接种FMDV,观察FMDV抑制情况.【结果和结论】结果显示,慢病毒处理BHK-21获得的转基因细胞中检测shRNA表达;通过O型FMDV接种发现转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24 h病毒拷贝量仅为普通细胞的1/3;O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3~5日龄乳鼠,在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下存活率也提高50%.构建的慢病毒介导多shRNA串联表达抗口蹄疫载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5 LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.     

一例体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构观察

作者应用石蜡切片及HE染色技术对体细胞克隆黄牛的肺脏及其细胞类型和形态进行了详细的观察。结果表明,光镜下,该体细胞克隆黄牛肺脏的组织结构与自然繁殖的黄牛肺脏的组织结构基本一致,包括支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡等结构,但体细胞克隆黄牛的细支气管管壁内的皱壁消失,其黏膜以单层立方上皮为主;肺泡处于半充容状态,肺泡腔狭小,肺泡膈较厚,其中含有较多胶原纤维和弹性纤维。肺泡壁的细胞结构不清,肺泡腔内有内容物,可能是发生病变引起。     

猪卵母细胞的皮质颗粒与多精受精

猪卵母细胞的体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）是进行体外生产胚胎（IVP）的重要方法。多精受精常会导致早期胚胎死亡。严重影响着猪胚的IVP技术。受精时皮质颗粒（CGs）中酶的释放使透明带（ZP）上的蛋白分子进行修饰，从而可阻止猪卵的多精受精。     

6－二甲氨基嘌呤对牛卵母细胞孤雌发育的影响

本研究系统探讨了 6-二甲氨基嘌呤 ( DMAP)对牛卵母细胞孤雌发育的影响。牛卵母细胞体外成熟 2 4 ,2 6,2 8或 30 h后 ,先用含 7%乙醇的培养液激活处理 5min,然后在含 2 mmol/L DMAP的培养液中培养 3h,或直接在培养液中进行培养。结果发现 ,经 2 mmol/L DMAP培养处理 3h的卵母细胞的激活分裂率和囊胚发育率均明显高于未处理的卵母细胞 ,特别是对于体外成熟 2 4 h和 2 6h的卵母细胞差异更为显著。如若在 DMAP处理的基础上同时加入 5μg/m L的细胞松驰素 ( CB) ,卵母细胞激活后的囊胚发育率则得到进一步提高 ( 48.7%比 37.5% )。研究结果表明 ,DMAP和 CB对卵母细胞激活后的孤雌发育有促进作用 ,并能降低卵龄所引起的激活效果差异     

不同受体胞质对牛体细胞核移植效果的影响

通过研究不同受体胞质对核移植效果的影响,结果发现:部分体外成熟16~18 h的牛卵母细胞,其细胞核已完成成熟,胞质可直接用于核移植而不需进行激活处理,直接进行核移植囊胚率达7.7%;体外成熟培养(IVM)30 h的TⅡ期受体胞质较IVM 20~22 h激活的TⅡ期胞质核移植效果差,不适宜作受体胞质;MⅡ期胞质核移植效果优于TⅡ期胞质,两组囊胚率分别为11.7%和5.2%(P<0.05)。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

过表达JHDM2A对猪iPSCs诱导效率的影响

研究旨在探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶(JHDM2A)对猪成纤维细胞诱导为多能干细胞效率的影响,并对其内在的分子机制进行探究。以猪成纤维细胞为材料,采用多西环素(DOX)诱导的慢病毒生产诱导多能干细胞(iPSCs)体系,在此基础上过表达JHDM2A,通过碱性磷酸酶染色和绘制诱导时间轴检测其对诱导效率的影响;普通PCR技术检测克隆的多能性;免疫荧光检测多能因子的蛋白表达;实时荧光定量PCR检测JHDM2A在形成克隆后以及克隆分化过程中对多能因子、组蛋白甲基化相关基因表达的影响。结果表明,JHDM2A过表达组细胞在第3天发生形态变化,第8天形成iPSCs克隆,相比于对照组分别提前了1和2 d。碱性磷酸酶染色结果显示,与对照组相比,JHDM2A过表达组克隆形态明显改善,染色着色更深,诱导效率提高8倍。普通PCR结果显示,JHDM2A过表达组iPSCs、对照组iPSCs以及猪成纤维细胞(PFF)均表达内源性Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog,且iPSCs的Oct4表达量高于PFF。免疫荧光结果显示,JHDM2A过表达组iPSCs表达Oct4、Sox2、Stat3、JHDM2A,弱表达SSEA1、SSEA4。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组和猪成纤维细胞相比,JHDM2A过表达组iPSCs的Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Oct4、Tcl1的表达显著升高(P<0.05),Tfcp2l1和Zfp57的表达显著降低(P<0.05);JHDM2A过表达组P5代iPSCs培养基去除DOX后,随着代数的增加,Sox2、Nanog的表达逐渐降低,Klf4、c-Myc的表达先升高后降低,Oct4、Tcl1、Tfcp2l1、Zfp57的表达先降低后升高。以上结果表明,过表达JHDM2A通过促进组蛋白去甲基化提高猪成纤维细胞的诱导效率。     

氨基酸对哺乳动物胚胎体外发育的影响

在培养液中添加氨基酸可促进胚胎发育，提高囊胚率和孵化率，增加胚胎的细胞数。本文对氨基酸在胚胎体外发育中的作用进行了综述，并对生殖道液、胚胎体外培养液和胚胎内氨基酸浓度的差异进行了比较。     

青年母牛在发情周期中卵泡发育波变化规律的研究

为揭示青年母牛卵泡生长发育的动态模式,作者利用B-型超声波诊断仪,对青年母牛在发情周期中卵泡生长发育的过程进行了连续观察。结果表明,卵巢上小卵泡(1~4 mm)、中卵泡(5~7 mm)和大卵泡(≥8 mm)的数量和直径均呈动态变化。大、中、小卵泡的数量、卵泡的发育要经历征集期、选择期、优势化、成熟期和闭锁退化的过程。青年母牛在整个发情周期中,优势卵泡的平均直径为13.6 mm,成熟卵泡的平均直径为13.80 mm,一个发情周期有3~4个卵泡发育波,其中有3个卵泡发育波的为多数(71.43%),有4个的为28.57%。