水牛支持细胞体外分离及培养

试验探讨了水牛(Bubalus bubalus Linnaeus)睾丸支持细胞(Sertolicell,SC)的分离、纯化以及培养过程中的形态学特性。结果发现,采用差异黏附培养法和高温培养法(38.5℃培养24h)纯化后,支持细胞的纯度达到了90%,说明差异黏附培养法和高温培养法均可用于纯化水牛睾丸支持细胞。     

猪卵母细胞的皮质颗粒与多精受精

猪卵母细胞的体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）是进行体外生产胚胎（IVP）的重要方法。多精受精常会导致早期胚胎死亡。严重影响着猪胚的IVP技术。受精时皮质颗粒（CGs）中酶的释放使透明带（ZP）上的蛋白分子进行修饰，从而可阻止猪卵的多精受精。     

BDNF和NGF对牛颗粒细胞体外生长的影响

在DMEM培养液中分别添加不同质量浓度的脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BD NF)和神经生长因子(Nerve growth factor,NGF),观察其对牛颗粒细胞体外生长的影响.结果显示:在DMEM中添加20μg/L的BDNF,可促进牛颗粒细胞的体外生长;在DMEM中添加5μg/L的NGF,可促进牛颗粒细胞的体外生长.结果表明,在DMEM培养液中添加一定质量浓度的NGF和BDNF可促进牛颗粒细胞的体外生长.     

小分子化合物促进猪iPSCs primed向naive状态转化的研究

为了探讨在培养体系中添加小分子化合物对Dox-inducible体系诱导获得的猪i PSCs primed向m ESC-like(naive)状态转化的影响,进而筛选出能够促进猪i PSCs primed向naive状态转化的稳定培养体系,试验采用添加小分子化合物的处理组naive转化培养体系[基础培养基+CHIR99021(3μmol/L)+PD0325901(1μmol/L)+LPA(10μmol/L)+LIF(10 ng/m L)+b FGF(4 ng/m L)+β-巯基乙醇+L-谷氨酰胺+非必需氨基酸+Dox(2μg/m L)]处理猪i PSCs,同时以DMEM/F12+Dox作为对照,对传代培养的i PSCs进行碱性磷酸酶活性、免疫荧光、qRT-PCR检测,以此来探讨此培养体系对i PSCs向naive状态转化的影响。结果表明:与对照组(DMEM/F12+Dox)克隆相比,处理组在形态上更为立体,边缘光滑清晰,碱性磷酸酶活性更高,免疫荧光检测显示多能性基因OCT4、表面特异性抗原SSEA-4及组蛋白H3K4me3的相对荧光强度显著高于对照组,naive相关基因ESRRB、STELLA、SOX2、OCT4的相对表达量显著提高。说明该体系对猪i PSCs primed向naive状态转化有一定的促进作用。     

沼泽型水牛FST基因克隆分析与组织表达模式

旨在克隆水牛卵泡抑素(follistatin, FST)基因,并对该基因进行生物信息学分析,检测其在水牛不同组织中的表达情况,为进一步探讨FST在水牛胚胎发育过程中的功能奠定基础。从水牛卵巢组织中提取RNA,反转录成cDNA后,利用RT-PCR技术克隆获得水牛FST基因CDS区的全长序列,并进行生物信息学分析。结果显示,水牛FST基因编码区全长1 035 bp,编码344个氨基酸。水牛FST基因与黄牛、鸡、绵羊、人、黑猩猩、褐家鼠、野猪和山羊的同源性分别为99.1%,81.4%,98.4%,91.9%,91.4%,89.3%,93.4%和81.4%,且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。FST蛋白包含40个α-螺旋、63个延伸链及241个无规则卷曲,分别占11.6%(40个),18.3%(63个)和70.0%(241个),为经典分泌蛋白。qRT-PCR结果显示,FST在水牛胃、肌肉、卵巢、睾丸、心脏、肝脏、肺脏和脾脏组织中均有表达,其中在肺脏和卵巢中表达最高,睾丸中表达最低。本研究克隆得到了沼泽型水牛FST基因,并对不同组织内FST进行了基础的生物信息学分析,为阐明FST在水牛胚...     

供体核种类对水牛核移植效果的影响

采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。     

6－二甲氨基嘌呤对牛卵母细胞孤雌发育的影响

本研究系统探讨了 6-二甲氨基嘌呤 ( DMAP)对牛卵母细胞孤雌发育的影响。牛卵母细胞体外成熟 2 4 ,2 6,2 8或 30 h后 ,先用含 7%乙醇的培养液激活处理 5min,然后在含 2 mmol/L DMAP的培养液中培养 3h,或直接在培养液中进行培养。结果发现 ,经 2 mmol/L DMAP培养处理 3h的卵母细胞的激活分裂率和囊胚发育率均明显高于未处理的卵母细胞 ,特别是对于体外成熟 2 4 h和 2 6h的卵母细胞差异更为显著。如若在 DMAP处理的基础上同时加入 5μg/m L的细胞松驰素 ( CB) ,卵母细胞激活后的囊胚发育率则得到进一步提高 ( 48.7%比 37.5% )。研究结果表明 ,DMAP和 CB对卵母细胞激活后的孤雌发育有促进作用 ,并能降低卵龄所引起的激活效果差异     

不同受体胞质对牛体细胞核移植效果的影响

通过研究不同受体胞质对核移植效果的影响,结果发现:部分体外成熟16~18 h的牛卵母细胞,其细胞核已完成成熟,胞质可直接用于核移植而不需进行激活处理,直接进行核移植囊胚率达7.7%;体外成熟培养(IVM)30 h的TⅡ期受体胞质较IVM 20~22 h激活的TⅡ期胞质核移植效果差,不适宜作受体胞质;MⅡ期胞质核移植效果优于TⅡ期胞质,两组囊胚率分别为11.7%和5.2%(P<0.05)。     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率（58.99%）、卵裂率（67.52%）和囊胚率（22.78%）,而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率（P〈0.05）。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率（P〈0.05）。同时我们还探讨了不同去核方法（盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system）对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率（P〉0.05）,而与Spindle-view法去核率没有差异（P〉0.05）。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著（P〉0.05）,但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著（P〈0.05）。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著（P〈0.05）;两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。     

基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望

本文阐述了基因工程和转基因技术研究的原理、基本路线,介绍了转基因技术和生产转基因动物的方法,总结转基因技术在哺乳动物领域的应用,提出了转基因动物面临的问题,并对转基因技术及转基因动物的前景进行了展望。