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111.
试验旨在探讨单精子胞浆内注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)法生产猪体外受精卵和应用猪ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因胚胎的可行性。首先对比了猪体外受精(in vitro fertilization,IVF)受精卵与ICSI受精卵的胚胎发育效率;然后观察了猪ICSI受精卵的双原核形成时间及效率,对精子注射到胞质后6~18h分6个时间段进行地衣红染色,对比精子进入卵胞质后的状态及原核形成;最后对猪IVF受精卵受精后8~10h及ICSI受精卵受精后12~14h进行EGFP-N1质粒(20ng/μL)胞质注射,观察胚胎发育效率及转基因效率。结果表明,ICSI受精卵的胚胎发育率(卵裂率89.4%和67.9%、囊胚率36.5%和16.1%)显著优于IVF组(P0.05),适合用于猪的体外受精卵试验;猪ICSI受精卵双原核在精子注射到卵胞质后12~14h形成,双原核形成率为54.90%,显著高于其余5个试验组(P0.05);ICSI受精卵胞质注射组胚胎卵裂率(86.2%和66.3%)、囊胚率(30.0%和13.6%)及转基因效率(18.5%和0)均显著高于IVF受精卵胞质注射试验组(P0.05)。本试验结果为采用ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
112.
试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体,且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析,为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因,采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒;利用BLAST程序进行同源性分析,Mega 7.0构建系统进化树,ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装,经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒,将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b,并进行病毒滴度测定;利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞,实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测,对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示,试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列,通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%,与其他物种同源性较高,和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示,pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒,病毒滴度为3.367×1010 GFU/mL,感染卵丘细胞后,实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高(P<0.01)。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析,发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。 相似文献
113.
探讨了不同影响因素(性别、胎龄、分离方法)对水牛原始生殖细胞(PGCs)分离培养的影响.结果显示:PGCs多层堆积生长形成克隆,该克隆具有明显的边界与饲养层区分;PGCs表达AKP和OCT-4;公胎牛组的克隆总数和克隆直径都显著高于母胎牛组,(179和32,(227.76±83.84)μm和(102.34±40.59)μm),P<0.05;在原代克隆数目上,80~90 d组只有16个克隆,显著低于其他各组(P<0.05),在克隆直径上,80~90 d组为(190.63±65.11)μm,也显著低于除70~80 d组外的其他各组(P<0.05),并且在最高传代数上,80~90 d组仅为3代,而其他各组都达到或超过了6代;机械分离组在克隆总数和直径上都显著高于胰酶消化组,(186和30,(216.95±77.41)μm和(140:t=38.76)μm),P<0.05,并且机械分离组的最高传代数为8代,而酶消化组仅为3代.结果表明,本试验分离培养出的水牛PGCs具有与已经分离培养出来的其他物种PGCs相似的生物学特性;公胎牛、胎龄小于80 d以及使用机械分离方法更利于水牛PGCs的分离培养. 相似文献
114.
猪胚胎体外培养影响因素的研究 总被引:1,自引:1,他引:0
以孤雌激活胚胎为研究对象,对猪胚胎体外培养过程中的相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后,用添加0.5%牛血清蛋白(BSA)的NCSU-23(北卡罗来纳州立大学-23)培养基培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加5%、10%和15%胎牛血清(FCS)的NCSU-23(11.8%,18.5%和10.3%,P0.01)。在NCSU-23中添加一定比例的TCM-199(10%,25%和50%),虽然对猪卵母细胞孤雌激活后的分裂率无显著影响(89.6%vs87.0%,83.4%和82.6%,P0.05),但囊胚发育率随着TCM-199比例的增加而显著下降(30.1%vs25.0%,11.1%和1.1%,P0.05)。结果表明:培养液中添加BSA的猪胚胎体外培养效果优于添加FCS;猪胚胎的体外培养不需要成分复杂的培养液。 相似文献
115.
实时荧光定量RT-PCR是检测低丰度mRNA的敏感方法,也是精确定量RNA拷贝数的有效方法,它的出现使得在少量细胞中定量基因的表达量,在小量基因组中分析基因突变和等位基因缺失成为可能。为了使这种检测技术更加稳定可靠,就必须在检测步骤的每一环节做到精确无误,而总mRNA的提取质量就显得十分重要。研究选择了牛MⅡ期的卵母细胞作为研究对象,对不同保存方法进行了检测和比较,结果显示,-196℃液氮和-80℃冰箱保存24 h的卵母细胞,总RNA品质并未明显下降;在-20℃或-80℃环境中长时间保存cDNA模板都会造成模板品质的下降。 相似文献
116.
SYBR Green实时荧光定量PCR检测水牛体细胞组蛋白乙酰化相关基因mRNA表达 总被引:4,自引:0,他引:4
以检测水牛成纤维细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT1)和脱乙酰化酶(HDAC1)转录活性为例,对SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台的建立进行了探讨.结果显示,适宜的引物,高质量RNA反转录得到的cDNA以及合适的PCR体系为SYBR Green实时荧光定量PCR能否成功的关键因素.本试验中3对引物的灵敏度高,其反应性能完全满足SYBR Green实时荧光定量PCR的要求.2个目的基因HAT1、HDAC1的扩增效率与参照基因H2A接近,试验结果可用2-△△Ct计算法进行分析.当cDNA模板量为0.5 μL(相当于总RNA 50 ng),引物为1 μmol/L时,SYBR Green实时荧光定量PCR能高效获得特异性强的目的产物. 相似文献
117.
118.
水牛卵母细胞孤雌激活方法研究 总被引:7,自引:0,他引:7
对体外成熟(IVM)27 ̄28h的水牛卵母细胞经7%酒精(EH)激活处理5min后,置入不同浓度的(0,0.625μg/ml,1.25μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)放线功酮(CHX)培养10h,而后固定染色或在胚胎培养液(CM)中继续培养检查激活分裂率。结果培养在0.625μg/ml和1.25μg/ml CHX的卵母细胞的激活分裂率和总原核形成率明显高于对照组(P〈0.05),而培养 相似文献
119.
供体核种类对水牛核移植效果的影响 总被引:11,自引:2,他引:11
采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。 相似文献
120.
本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因(ICSI—mediatedgenetransfer。ICSI.Tr)操作后,先用5ixmol/L的离子霉素(ionomycin,Ion)激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg/mL放线菌酮(cycloheximide,CHX)培养5h(CHX5h组)、10μg/mLCHX培养3h后再用2mmol/L的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养2h(CHX3h-DMAP2h组)或用培养液(CM)培养3h后再用2mmol/L6-DMAP培养2h(CM3h.DMAP2h组)。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h.DMAP2h组(66.7%比49.5%,p〈0.05;66.7%比40.0%,p〈0.01;22.2%比9.9%,p〈0.05)。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h.DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组(p〈0.05),2原核(pronucleus,PN)百分率则显著提高(42.4%比23.8%,p〈0.05;44.6%比23.8%,p〈0.01)。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。 相似文献