外源GA_3影响牡丹花芽DNA甲基化水平和相关酶基因的表达分析

【目的】外施赤霉素(GA)是生产上辅助解除牡丹花芽休眠进行反季节盆花生产的常用手段,赤霉素如何发挥作用解除牡丹花芽休眠是未解的科学问题,本文旨在明确赤霉素是否通过表观遗传方式参与内休眠调控。【方法】从DNA甲基化入手,以4年生‘鲁菏红’为材料,500 mg·L~(-1)的GA_3处理花芽,并在处理后0.5、1、3和5 d后取健壮顶芽,CTAB法提取花芽DNA,HPLC技术测定GA_3处理后牡丹花芽DNA甲基化水平的变化;利用转录组分析结合RACE技术得到牡丹3种DNA甲基转移酶基因PsCMT、PsMET、PsDRM和DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列,生物信息学方法比对基因序列并分析可能的结构域,MEGA 5.0构建系统发育树;以Actin为内参,利用q PCR方法分析其组织表达特性和对GA_3的响应。【结果】3种DNA甲基转移酶基因(Dnmts)的开放阅读框长短不一,PsCMT、PsMET、PsDRM开放阅读框长度分别为1 118、1 056、2 175 bp,编码的氨基酸数目分别为372、351、724。3种DNA甲基转移酶均有甲基转移酶结构域。而DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列较长,开放阅读框为6 636 bp,编码2 211个氨基酸。PsROS1上存在保守的DNA糖基化结构域。系统发育分析表明,牡丹中的PsCMT和PsDRM蛋白与葡萄的Vv CMT2蛋白亲缘关系最近,PsMET和PsROS1与大部分木本植物聚为一支,与烟草等距离较远。PsCMT、PsMET、PsDRM在牡丹初花期的各个组织(根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮)中均有表达,其中在牡丹根中表达量较高,而PsROS1在心皮中表达量最高。GA_3处理5 d,牡丹花芽迅速萌动,60 d时萌动率为97.5%,成花率为92.5%;对照20 d时才有少量花芽萌动,至60 d时萌动率仅为23.1%。GA_3显著降低了牡丹花芽DNA甲基化水平(P0.01),从处理前的38.9%降至处理5 d时的28.7%;GA_3处理提高了PsCMT和PsROS1的表达水平,降低了PsDRM的表达水平,而PsMET的表达水平差异不显著。【结论】GA_3处理通过诱导PsROS1表达、抑制PsDRM表达导致了DNA低甲基化,进而促进了牡丹休眠解除,可能是赤霉素发挥作用的一种重要方式。     

转基因植物的筛选与检测

近年来,转基因的研究进展很快,对转基因植株进行筛选检测是基因转移的必须环节。本文综述了转基因中选择试剂的种类和应用范围;转基因植株的检测方法。Ｋａｎ抗性基因、Ｇｕｓ基因、Ｂａｒ基因是可安全使用的选择标记基因,其它选择基因的安全性尚待进一步评价。Ｇｕｓ基因可检测外源基因的表达部位,可作为首选的报告基因。ＰＣＲ是早期检测的较好方法。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交特异性强,可以研究外源基因的整和状态、位置数及外源基因的完整性和稳定性,因而应用最多。Ｗｅｓｔｅｒｍ杂交结果与性状表现有直接关系。     

芍药花粉活力测定方法的研究

鉴定花粉活力是杂交育种的重要环节,本试验研究了芍药花粉离体萌发的条件,并利用8个芍药品种,建立了新鲜花粉活力快速测定方法.试验表明,芍药花粉离体萌发的适宜条件为50mg/L硼酸、100g/L蔗糖、pH值7.0～7.5、25℃下培养6h,在此条件下可获得较高的萌发率.与TTC法和醋酸洋红法相比,I2-KI染色法的测定结果与离体培养萌发法的测定结果相近,并相关性显著,I2-K(I染色法适于芍药新鲜花粉活力较快捷、简便、准确的测定.     

三种不同衰老类型牡丹叶片叶绿素荧光特性的比较

以三种不同衰老类型的牡丹品种卷叶红、大胡红和肉芙蓉为试材,比较其叶片在不同时期的强光下叶绿素荧光特性的差异,探讨牡丹叶片光抑制发生的机理和叶片衰老差异的原因。结果显示,7月中旬至8月下旬,与大胡红和肉芙蓉相比,卷叶红的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ电子传递量子产率(PSⅡ)和光化学猝灭系数(qP)下降较小,且保持了较高的非光化学猝灭系数(NPQ)。表明叶黄素循环的热耗散迅速增加,提高了对强光的适应,而可逆失活和不可逆破坏则加重了光合机构的损伤,这造成了衰老的先后次序为肉芙蓉、大胡红、卷叶红。Fv/Fm、NPQ、qP和PSⅡ对光强响应的差异明显,使之可以作为鉴定耐光抑制能力大小的指标。     

低温解除牡丹芽休眠进程中内源激素的变化

以4～5年生牡丹'胡红'为试材,研究1～7周不同低温处理时间对其开花展叶的影响.根据花芽萌动和开花情况结合激素的变化动态,将低温解除花芽休眠进程划分为:低温累积期、休眠解除启动期、休眠基本解除期、休眠彻底解除期4个时期.分别测定低温处理期内和进入温室后内源GA,,ABA,CTK,IAA及其比值的变化.结果表明:低温期内GA,,ABA,CTK质量分数的增减和GA,/ABA比值的变化可明显地反映低温解除花芽休眠的进程.其中,GA,/ABA比值的变化与休眠的进程直接对应.进入温室后牡丹花芽内各激素的变化进一步证明GA3和CTK是解除休眠的促进物,ABA是解除休眠的抑制物.低温解除牡丹休眠是通过调节休眠解除的促进物和抑制物之间的平衡来实现的,是多因素综合作用的结果.     

玉米自交系亲缘关系的SSR分析

了解玉米自交系亲缘关系,可明确自交系系谱及所属的杂种优势群,为玉米杂交育种亲本选配提供指导。选用了分别位于10对染色体上的30对引物对35份玉米自交系（部分为改良自交系）进行了SSR（simple sequence repeat）分析。通过银染检测,在35份自交系中共检测出299个等位基因变异,变幅4-19个,平均9.97个;多态性信息量为0.869-0.108,平均为0.593。利用UPGMA（Unweighted pair groupmethod arithmetic averages）法将供试自交系划分为5类,并将改良自交系归入相应优势群。该划分结果与根据地理来源、种质系谱的分类结果基本一致,利用SSR进行玉米自交系亲缘关系分析是准确可靠的。分子标记辅助的自交系改良将成为玉米品种改良的重要途径。     

牡丹花芽休眠解除进程中碳氮比的变化与低温处理时间的关系

以牡丹‘鲁荷红’花芽为材料,对不同低温处理的牡丹花芽的4种营养物质的含量进行测定,同时测定淀粉水解酶和谷氨酰胺合成酶的活性。目的是探索其变化趋势与牡丹休眠解除的相关性。试验结果表明,在牡丹花芽休眠解除过程中,淀粉、可溶性糖与可溶性蛋白质均有不同程度的增加;但是基本打破休眠时,即低温15天时可溶性蛋白含量有所降低,打破休眠后,又恢复含量;而游离氨基酸的量变化不明显,整个过程趋于稳定。其花芽的总体碳氮比,在未感受低温时,比值较低,感受低温后的花芽其总体的碳氮比持续处于较高的水平,并趋于稳定。在牡丹花芽休眠解除过程中,淀粉水解酶活性持续缓慢升高,可溶性糖含量升高,碳水化合物积累,是碳氮比升高的重要原因。谷氨酰胺合成酶活性呈现先升高后下降的趋势, 在感受低温15天时达到最高值。     

牡丹休眠相关基因PsGRASs筛选、克隆和表达特性分析

通过筛选、克隆牡丹PsGRASs基因并进行表达模式分析,初步解析其是否参与牡丹休眠解除,以期为牡丹反季节催花提供候选基因。利用HMM(Hidden Markov Model)模型,基于GRAS基因家族的种子(Pfam号为PF03514)序列,利用BioEdit软件对牡丹花芽休眠的454测序转录组数据进行本地检索,筛选到2个具有GRAS结构域的序列。通过RACE扩增得到了其全长cDNA,其中PsGRAS1序列为2 308 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 848 bp,编码615个氨基酸;PsGRAS2为2 034bp,ORF为1560bp,编码518个氨基酸,两个编码PsGRASs蛋白的同源性为19.87%。进化树结果表明,PsGRAS1蛋白与拟南芥GRAS家族中的DELLA亚家族的GAI和RGLs聚到一个大的分支,PsGRAS2蛋白与拟南芥HAMs(AtSCL6/15/22/26/27)并为一支,说明PsGRAS1和PsGRAS2来自GRAS家族的两个不同分支。组织表达结果显示PsGRAS1和PsGRAS2在牡丹初花期不同组织中表达水平不同,PsGRAS1在叶中表达水平最高,在雄蕊中最低;而PsGRAS2在苞片中表达水平最高,在花瓣中最低。在牡丹花芽休眠解除过程中,PsGRAS1呈下调趋势,低温28 d表达水平最低,而PsGRAS2呈先上调后下调趋势,低温14 d表达水平最高。在外源GA3处理7 d的牡丹花芽中,PsGRAS1的表达显著下降,而PsGRAS2显著提高。这表明PsGRAS1和PsGRAS2都参与了休眠过程,但功能不同。     

牡丹花粉离体萌发的研究

采用固体培养法研究了3个野生牡丹种和1个栽培品种的花粉萌发情况。结果表明:固体培养基上培养6 h左右,牡丹花粉已有较高萌发率,是调查花粉萌发率的适宜时期。牡丹花粉萌发的适宜条件为50 mg/L硼酸、100 g/L蔗糖、pH6.5~7.0,可获得较高的萌发率。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。