禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水 肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞（LMH）对病原进行分离,采用PCR、透射电镜（TEM）观察和间接免疫荧光试验（IFA）对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体（SPF）鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸（cGAS）、干扰素刺激因子（STING）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β、干扰素调节因子7（IRF7）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列（43 708 bp）;遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照（DMEM/F12处理）相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ β差异达极显著水平（P<0.01）,IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平（P<0.05）,STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。     

福建柏愈伤组织诱导与抗褐化研究

【目的】比较不同抗褐化剂减轻福建柏组织培养过程中褐化现象的效果,以提高福建柏愈伤组织培养的增殖分化能力。【方法】以福建柏鳞叶和茎段为外植体,通过单因素试验,研究0.0～2.5 mg/L NAA和2,4 D及0.0～3.0 mg/L IBA对愈伤组织诱导率与生长状态的影响;以福建柏茎段为外植体,采用单因素和多因素组合试验,研究100～2 000 mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、100～1 000 mg/L活性炭（AC）和V_C以及不同质量浓度VC与AC组合,对愈伤组织污染率、死亡或褐化率及诱导率的影响;以诱导的愈伤组织为材料,采用单因素试验,研究100～1 000 mg/L PVPP、100～300 mg/L V_C、200～1 000 mg/L AC、30～100 mg/L V_B对愈伤组织增殖生长量、增殖率、褐化率及PPO、POD活性的影响。【结果】① 不同质量浓度NAA、2,4-D和IBA对福建柏鳞叶愈伤组织的诱导率总体高于茎段,各生长素对福建柏鳞叶和茎段愈伤组织的诱导率均表现为NAA＞IBA＞2,4-D,所有处理中以1.0 mg/L NAA对福建柏鳞叶愈伤组织的诱导率最高,为83.33%;以0.5 mg/L NAA对茎段愈伤组织的诱导率最高,为61.11%;愈伤组织生长状态和抗褐化效果优劣依次为NAA、2,4-D、IBA。②仅100 mg/L V_C+200 mg/L AC处理的愈伤组织污染率低于不添加抗褐化剂的对照;死亡或褐化率仅500 mg/L PVPP处理与对照相同,均为0.00%,其余处理均高于对照;诱导率则以不同质量浓度PVPP、1 000 mg/L VC、100 mg/L V_C＋200 mg/L AC处理与对照相当或高于对照,其余处理均低于对照;愈伤组织生长状态总体以PVPP处理表现最优。③仅300 mg/L PVPP、200和400 mg/L AC处理的愈伤组织增殖率高于对照,增殖生长量仅100和200 mg/L PVPP、100 mg/L V_C、200 mg/L AC处理高于对照;所有处理中以200 mg/L AC处理的愈伤组织增殖率和增殖生长量最高,分别为70.00%和10.07 g;各抗褐化剂对福建柏愈伤组织增殖效果的优劣依次为PVPP、AC、V_C、V_B。④不同抗褐化剂处理的愈伤组织褐变率均呈先增加后趋于稳定的变化趋势,但变化幅度存在显著差异;各抗褐化剂的抗褐化效果优劣依次为AC、PVPP、V_C、V_B。⑤不同质量浓度PVPP、V_C、AC处理对福建柏愈伤组织PPO和POD活性的影响具有显著差异,但各处理PPO活性均与对照无显著差异,POD活性以500 mg/L AC处理显著高于其他处理。【结论】在福建柏愈伤组织诱导阶段,愈伤组织的褐化与生长素种类有关,生长素NAA、2,4-D适用于福建柏愈伤组织的诱导,IBA诱导的愈伤组织容易褐化,添加适量抗褐化剂能减少愈伤组织的褐化情况。在愈伤组织增殖培养阶段,适宜质量浓度的PVPP、AC作为抗褐化剂能有效减缓福建柏愈伤组织的褐化进程,保持愈伤组织的正常增殖生长,但高质量浓度的抗褐化剂会抑制愈伤组织的生长。     

灌浆初期高温胁迫对水稻籽粒活性氧积累及产量形成的影响

【目的】研究灌浆初期高温胁迫对水稻籽粒活性氧积累及产量形成的影响,为耐热水稻种质资源的筛选和鉴定提供理论依据。【方法】以长江中下游地区普遍推广种植的8个水稻品种为材料,在灌浆初期进行高温胁迫（38 ℃/32 ℃,昼/夜）,研究各水稻品种在灌浆初期高温胁迫下的ROS含量、抗氧化酶活性、淀粉合成相关酶活性、产量及其构成要素以及稻米品质的差异。【结果】与对照相比,灌浆初期高温胁迫导致水稻籽粒O^-₂·和H₂O₂含量及抗氧化酶活性显著增加。在不同水稻品种中,淀粉合成相关酶活性对灌浆初期高温胁迫的响应具有差异性。高温胁迫下,产量损失较大水稻品种的O^-₂·和H₂O₂含量增幅较大,淀粉合成酶活性受高温胁迫影响也较大。灌浆初期高温胁迫导致水稻结实率、千粒质量、收获指数和产量显著下降,其中黄华占和湘两优900的产量损失较小,在灌浆初期的耐热性较强;粤王丝苗、泰优390和湘两优2号的产量损失较大,在灌浆初期的耐热性弱。灌浆初期高温胁迫导致糙米率、精米率和淀粉含量显著下降,垩白粒率和垩白度增加。高温胁迫下,产量损失较大水稻品种的淀粉含量下降幅度较大,稻米品质受高温胁迫影响也较大。在高温胁迫下,水稻产量与ROS含量显著负相关,而与抗氧化酶活性显著正相关。产量、籽粒加工指标、淀粉含量和淀粉合成酶活性的抗逆系数与ROS含量的抗逆系数显著负相关,而与抗氧化酶活性的抗逆系数显著正相关。【结论】灌浆初期高温胁迫导致水稻籽粒ROS过量积累是降低淀粉合成酶活性和淀粉含量,进而导致产量和稻米外观加工品质下降的重要因素。ROS的增加量可作为灌浆初期水稻耐热性评价的参考指标。     

宁夏地区春玉米灌溉需水量特征研究

【目的】提高宁夏地区春玉米的灌溉效率,优化农业资源配置。【方法】依据宁夏地区11个站点1960-2019年的气象资料,确定宁夏地区年际及春玉米生育期不同水文年型的有效降雨量;然后,利用ET₀ Calculator软件计算参考作物腾发量,并结合作物系数法计算作物需水量,求得宁夏地区年际及不同水文年型下春玉米各生育期的作物需水量、灌溉需水量、耦合度和水分盈亏指数。【结果】1960-2019年间,宁夏地区年有效降雨量波动较大(158.5~424.2 mm),北部引黄灌区、中部干旱带和南部山区春玉米生育期有效降雨量分别为123.9,205.4和334.4 mm。宁夏全区春玉米生育期需水量为482.0~690.7 mm,其中南部山区和中部干旱带春玉米需水量有降低趋势,而北部引黄灌区有增大趋势。北部引黄灌区、中部干旱带和南部山区春玉米灌溉需水量分别为566.8,413.0和147.6 mm;在枯水年、平水年和丰水年宁夏全区春玉米灌溉需水量分别为448.5,378.9和317.0 mm。南部山区降雨对作物需水量的满足程度最高,耦合度为0.70,是北部引黄灌区的3.89倍。【结论】宁夏南部山区应以集雨技术为基础发展雨养玉米种植;北部引黄灌区和中部干旱带需要大力发展节水灌溉,其中在北部引黄灌区春玉米大喇叭口期、抽雄期和乳熟期需要分别补灌87.2,79.6和275.6 mm,在中部干旱带需要分别补灌65.7,62.4和212.8 mm。     

丛枝菌根真菌对元宝枫生长及其根系形态的影响

【目的】阐明丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal,AM）真菌对元宝枫生长状况及根系形态特性的影响,探讨元宝枫根系形态与其生长发育的关系。【方法】在元宝枫幼苗生长基质中接种摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）和根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）2种AM真菌,以不接种AM真菌为对照,通过盆栽试验,培养90 d后,测定元宝枫的生长状况、根系活力及根系形态指标,利用单因素方差分析和多重比较方法,分析接菌与不接菌处理之间的差异,采用envfit ()函数、冗余度分析和变差分解分析元宝枫生长状况与其他指标间的关系。【结果】①接种2种AM真菌后,元宝枫株高、地径、茎干质量和根系活力较对照显著提高,根冠比下降。根内根孢囊霉对元宝枫的促生作用比摩西斗管囊霉显著。②与对照相比,接种2种AM真菌后,元宝枫根表面积和根体积显著增大,粗根根长占总根长的比例增加,细根根长占总根长的比例显著降低。根内根孢囊霉对元宝枫根系形态的影响比摩西斗管囊霉显著。③元宝枫生长状况与其根系活力和根系形态密切相关。【结论】接种AM真菌有助于增强元宝枫的根系活力,改善其根系形态,促使其汲取更多养分,进而提高其生物量。     

瓠瓜KNOX基因家族全基因组鉴定及组织表达分析

【目的】 探明瓠瓜KNOX基因家族特征,在瓠瓜全基因组水平上对KNOX基因家族成员进行鉴定和分析,研究其组织表达模式。【方法】利用生物信息学方法,对瓠瓜KNOX家族基因成员进行鉴定、编码蛋白理化性质分析及家族成员结构域和保守基序分析,利用MEGA 5.05软件构建系统进化树,采用实时荧光定量PCR技术,分析KNOX基因在瓠瓜不同组织（根、茎、叶、花、果实）中的表达情况。【结果】鉴定到12个瓠瓜KNOX家族基因,这些基因分布在6条染色体上,且均定位于细胞核。大多数瓠瓜KNOX家族蛋白含有同源异型盒蛋白特有的4种结构域KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN。系统进化分析将瓠瓜KNOX基因分为KNOX Class Ⅰ和KNOX Class Ⅱ 2大类群,2个类群又可进一步分为5个分支,其中Class Ⅰ-C为瓠瓜特有的进化分支。KNOX基因启动子区有多个激素响应元件和植物生长相关元件。组织表达分析发现,瓠瓜KNOX基因具有不同的表达模式,KNOX Class Ⅰ类基因表达具有组织特异性,在根、茎和果实中表达量较高,在其余组织中表达量较低或不表达,其中Lsi04G014450在根和茎中表达量最高,Lsi11G006380在果实中表达量最高;KNOX Class Ⅱ类基因在所有组织中均有较高表达。【结论】瓠瓜KNOX基因家族有12个成员,分布于6条染色体上,在进化关系上可分为5组,具有瓠瓜特有的进化分支,在不同组织中的表达具有特异性。     

桂花OfWRKY120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究

【目的】根据前期基因家族鉴定分析得到OfWRKY120,对该基因盐胁迫响应的功能进行分析,为桂花盐胁迫下的调控机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法对OfWRKY120保守结构域、系统进化进行分析,并采用qRT-PCR技术研究盐胁迫下OfWRKY120在桂花叶片中的相对表达量。构建OfWRKY120超表达载体,使用亚细胞定位、酵母自激活检测等探究其特性,将该基因瞬时转化本氏烟草后,对烟草进行盐处理,利用DAB、NBT染色和相关生理指标的测定,解析瞬时转化OfWRKY120对本氏烟草耐盐性的影响。【结果】OfWRKY120基因全长为1 422 bp,编码474个氨基酸,存在WRKY superfamily保守结构域。盐胁迫能够激活桂花叶片中OfWRKY120的表达,在72 h时相对表达量最高,与对照有显著差异。亚细胞定位结果表明,OfWRKY120定位于细胞核。酵母自激活结果显示OfWRKY120无自激活活性。盐胁迫后,OfWRKY120瞬时过表达植株的超氧阴离子(O^-₂·)和脯氨酸含量显著高于空载对照,且DAB和NBT染色表现出更深的颜色。本氏烟草中的qRT-PCR结果显示,OfWRKY120显著降低了NbCAT的表达,而显著提高了NbP5CS1、NbP5CS2和NbP5CR的表达。【结论】OfWRKY120过表达增加了盐胁迫下本氏烟草中活性氧（ROS）的含量,导致植物对盐胁迫的敏感性提高。     

芍药属组间杂交种皮开裂种子的解剖观察与胚培养

【目的】探究芍药属组间杂交种皮开裂种子的内部状态和胚培养成苗表现,为揭示种皮开裂种子的成苗潜力、提高组间远缘杂交育种效率提供参考。【方法】以24个芍药属组间杂交组合种皮开裂的种子为试验材料,解剖后观察并统计胚和胚乳的发育情况,通过离体培养观察胚的萌发和生长规律,分析不同组合种皮开裂种子发育和成苗差异。【结果】芍药属24个组间杂交组合中均出现了种皮开裂的杂交种子,平均种皮开裂率高达61.08%;1 767粒种皮开裂种子中,有11.09%的胚乳已腐烂;胚乳未腐烂种子中,约90%以上种子的胚乳存在不同程度的损伤或病变,24.18%的种子内部未观察到可见胚。对解剖得到的1 185个组间杂种胚进行离体培养发现,有24.73%的胚不萌发,63.47%的胚生长异常,仅有4.47%的胚能正常生长,得到完整植株。胚培养得到的完整植株具备良好的活力,移栽成活率达到86.79%。24个杂交组合种皮开裂种子通过离体胚培养共得到46株移栽成活的组间杂种苗,平均成苗率为2.60%,接近正常组间杂交种子的播种成苗率（2.75%）。【结论】种皮开裂现象在芍药属组间杂交种子中普遍存在,是组间远缘杂交障碍的重要表现之一,用离体胚培养技术能有效克服这类障碍,提高成苗率。     

海鲜菇菌糠微生物发酵及其在肉羊瘤胃降解特性研究

【目的】探究不同微生物菌剂对海鲜菇菌糠发酵效果的影响,并研究其在肉羊瘤胃内降解特性。【方法】以海鲜菇菌糠为主要原料,分别添加0.1%植物乳杆菌、0.1%活菌多复合发酵菌剂、0.1%活菌多复合发酵菌剂＋3%糖蜜以及3%糖蜜,以不添加菌剂和糖蜜的处理为对照组。每处理3个重复,室温厌氧发酵45 d后,取样测定其营养成分（干物质（DM）、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量）及发酵品质（pH及乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量）。取发酵效果最佳处理的发酵菌糠和菌糠原料进行瘤胃降解试验,测定发酵前后海鲜菇菌糠DM、CP、NDF和ADF不同发酵时间点（4,8,12,24,48及72 h）的瘤胃降解率,并计算降解参数及有效降解率。【结果】与对照组相比,各试验组CP含量均升高,NDF含量均降低,其中0.1%活菌多复合发酵菌剂＋3%糖蜜处理发酵效果最佳,其CP含量提高了9.69%（P＜0.05）,NDF、ADF和半纤维素含量分别下降了9.12%（P＜0.05）,2.66%和28.71%。各试验组pH较对照组均显著降低（P＜0.05）,乳酸含量均升高,其中0.1%活菌多复合发酵菌剂＋3%糖蜜处理组pH值最低,为3.29,乳酸含量最高（7.84%）,较对照组提高了33.11%（P＜0.05）。0.1%活菌多复合发酵菌剂＋3%糖蜜处理组菌糠DM、CP、NDF和ADF的72 h瘤胃降解率较发酵前分别提高了8.61%,8.58%,14.75%和8.93%（P＜0.05）,有效降解率较发酵前分别提高了7.66%,11.75%,20.74%和3.39%（P＞0.05）。【结论】在海鲜菇菌糠中添加0.1%活菌多复合发酵菌剂＋3%糖蜜能明显提高其营养价值、发酵品质及其在肉羊瘤胃中的降解率。     

扭果花旗杆组织培养与再生体系的建立

【目的】以扭果花旗杆(Dontostemon elegans)根和下胚轴为外植体,建立扭果花旗杆组织培养体系,为后续遗传转化体系的建立提供技术基础。【方法】以MS培养基为基础培养基,利用萘乙酸(NAA)探究根和下胚轴直接诱导不定芽情况,利用2,4 二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、NAA、苯基噻二唑基脲(TDZ)、吲哚丁酸(IBA)进行愈伤组织诱导及分化和不定芽生根试验,统计愈伤组织诱导及分化和不定芽生根情况,确定扭果花旗杆组培体系最佳培养基类型。【结果】（1）由根和下胚轴直接诱导不定芽的最适培养基分别为MS+0.3 mg/L NAA和MS+0.6 mg/L NAA,直接诱导不定芽的最佳外植体为根。（2）扭果花旗杆根和下胚轴都能诱导愈伤组织,其中根系诱导愈伤组织速度最快且状态最佳,其次为下胚轴。根系愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,诱导率可达100.00%;下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.3 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA,诱导率可达100.00%。（3）根系和下胚轴的最佳愈伤组织分化培养基均为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA,分化率分别为100.00%和86.66%。（4）最佳生根培养基为MS+0.5 mg/L IBA,生根率可达50%以上。（5）将组培苗移至土壤后,在光照培养室培养15 d,其存活率可达83.33%。【结论】建立的扭果花旗杆组培体系可获得与实生苗形态一致的组培苗,为扭果花旗杆遗传转化体系的建立奠定了技术基础。