桑树组织培养诱导多倍体植株

桑(Morus)为多年生落叶木本植物,是我国重要的经济树种,桑叶为家蚕饲料.人工选育的三倍体桑树品种,细胞体积较二倍体桑大1倍以上,不育,营养生长旺盛,产叶量与叶质明显高于目前生产上使用的二倍体桑树品种.     

红外高温热敏对桑椹菌核病菌子囊孢子的杀灭试验

桑椹菌核病是制约果桑生产的一个瓶颈性问题,目前多采用化学药剂对其进行防治.试验用红外高温热敏对桑椹菌核病菌的子囊盘进行照射,设立3个不同处理时间,即30 s,45 s,60 s,研究红外线对子囊孢子杀灭的瞬时温度.结果表明,当红外高温热敏装置对其子囊盘照射30 s和45 s可使子囊盘变形皱缩,但不能使子囊盘内的子囊孢子灭活；照射60 s,其温度上升为125℃,不仅能使子囊盘明显变形皱缩,而且可以有效地杀灭子囊盘内的子囊孢子.其试验结果可为工业上生产手持式红外高温热敏装置提供生物学实验依据.     

桑椹缩小性菌核病病原菌的分类和生物学特性及抑菌药剂筛选

对分离到的桑椹缩小性菌核病病原菌进行分类鉴定和生物学特性研究,并进行病原对抑菌药剂敏感性的室内试验,为有效防控该病的危害提供科学依据。在对病原菌形态特征观察的基础上,通过与已知近缘菌株核糖体大亚基rRNA序列的比对,明确该病原菌在分类上属于核盘菌科(Sclrotiniaceae)核地杖菌属(Scleromitrula S.Imai)核地杖菌(Scleromitrula shirai-ana)。该病原菌的主要形态与生物学特性为:子实体单个子囊内的8个子囊孢子在未成熟期排列为2列,随着子囊孢子的生长发育,排列方式逐渐由2列变为不规则的线性排列;病原菌生长的适宜温度为20～30℃,最适宜生长的温度为25℃,菌丝及菌核的致死温度为50℃;病原菌生长的适宜pH范围为5～8,最适宜生长的pH为7。80%百菌清对该病原菌菌丝生长有较强的抑制作用,其EC50值为0.012 0 mg/mL,可选择百菌清对桑椹缩小性菌核病进行化学防控试验。     

四倍体果桑嘉陵30号再生植株的研究

以四倍体果桑品种嘉陵30号(Morus atropupurea Roxb.)的春芽和冬芽为外植体,建立了嘉陵30号的高频再生体系。结果表明,冬芽比春芽更适合作外植体,低温处理后再用赤霉素处理对解除冬芽休眠效果最好;0.1%HgCl_2消毒15min且在培养基中添加300mg/L噻孢霉素钠盐(Cef,Cefotaxime Sodium Salt)能有效控制污染;培养基MS+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA适用于果桑的初代和继代培养。嘉陵30号通过直接器官发生途径再生,使用不定芽诱导丛生芽此种增殖方式效果更佳,增值系数高达7.04,且苗粗壮,生长旺盛,最适诱导培养基为1/2MS+0.6mg/L IAA,生根率可达87.5%,根系粗壮。     

果叶兼用多倍体新桑品种的选育及其光合特性研究

 【目的】选育果叶兼用多倍体新桑品种,使桑树利用多元化,提高桑树的经济效益;探讨桑树多倍化以后光合特性,为桑树多倍体育种提供理论指导。【方法】采用单株选优与化学诱变相结合的染色体工程,选育果叶兼用多倍体桑树品种(2n=4X=56);测定多倍体与无性系亲本二倍体桑的形态性状,光合日变化和叶绿素含量,对叶绿体超微结构进行观察。【结果】该品种年平均桑产叶量和产果量较对照品种‘红果2号’（2n=2X=28）分别高38%和45.89%。该品种桑叶养蚕成绩中的万头蚕产茧量、万头蚕产茧层量和4—5龄每100 kg桑叶产茧量较对照叶用桑‘湖桑32号’分别高4.65%、4.35%和5.2%。于2009年通过重庆市蚕桑品种审定。四倍体叶绿素含量、RuBPcase羧化活性提高,叶绿素a与叶绿素b的比值降低,叶绿体内部基粒片层和基质片层丰富,垛叠疏松,排列有序,净光合速率（Pn）高于无性系亲本二倍体。【结论】多倍体新桑品种不但桑叶产量和质量高,且产果量高;体细胞染色体加倍以后,光合性能增强。     

桑树EIN2基因的分离与表达

EIN2是植物体内乙烯信号转导的中心元件,负责将乙烯信号由内质网传递到细胞核中。本文通过检索桑树基因组数据,获得一个EIN2候选基因(MaEIN2),并进行生物信息学分析和表达分析。该MaEIN2全长5614 bp,由7个外显子和6个内含子组成,包含3921 bp的CDS,编码1036个氨基酸残基。MaEIN2在进化树中与草莓、桃树等双子叶植物的EIN2蛋白关系较近,与单子叶植物关系较远。MaEIN2在老叶和成熟果实中的表达量分别高于在幼叶和幼果中,且随果实发育呈逐渐上升趋势,MaEIN2可能与器官的成熟衰老有关。选用乙烯利、ABA和NaCl处理桑树种苗,乙烯利能够促进MaEIN2的表达,而ABA和NaCl抑制MaEIN2的表达。本文为深入研究MaEIN2基因的功能奠定了基础。     

桑树MaDFR的克隆及功能分析

【目的】克隆桑树（Morus alba L.）二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）基因,并通过烟草过表达研究其对烟草黄酮生物合成的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR的方法从桑树中克隆出MaDFR,采用农杆菌介导的遗传转化技术,将MaDFR导入模式植物烟草中,获得具有卡那抗性的转基因烟草植株,通过基因组PCR鉴定转基因阳性植株,采用反向PCR的方法分析T-DNA在烟草中的插入位点。通过定量PCR的方法分析MaDFR在烟草中的表达水平,AlCl₃分光光度法测定转基因烟草中总黄酮含量,通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力分析总黄酮酸水解前后的抗氧化活性,最后通过高效液相色谱（HPLC）分析烟草花冠中花青素的含量及种类。【结果】从中桑5801中克隆并获得了全长为1 026 bp的MaDFR,编码341个氨基酸残基,其蛋白质具有典型的NADPH结合位点。获得7株具有卡那抗性的烟草转基因株系。分子鉴定4株为转基因阳性株系。MaDFR在转基因烟草中能够表达,但不同转基因株系之间MaDFR表达水平存在较大差异。转基因烟草叶片中总黄酮含量明显增加,其中,DFR-4和DFR-7 2个株系分别增加了30.4%和27.6%,DFR-2和DFR-5分别增加了19.8%和14.2%。抗氧化活性分析发现转基因株系叶片中未酸解总黄酮抗氧化活性存在较大差异,DFR-2、DFR-4的抗氧化能力比对照组提高了近5倍,而DFR-5和DFR-7与对照组没有显著性的差异,转基因株系叶片中总黄酮的抗氧化活性与MaDFR的表达水平具有显著的正相关性。转基因株系叶片中酸解总黄酮抗氧化活性与总黄酮的含量具有显著的正相关性。MaDFR在烟草中的过表达能够增加花冠中花青素的含量,DFR-4株系中花青素含量增加了15%,DFR-5和DFR-7 2个株系中花青素的含量增加了一倍,但转基因烟草花冠中花青素种类没有发生改变。【结论】MaDFR在烟草中的过表达能够显著增加烟草的总黄酮含量及抗氧化作用,也可以显著增加烟草花冠中花青素的含量,但不能改变花青素的种类,说明该基因在矢车菊素类花青素的生物合成代谢路径中具有重要作用。     

国家一流本科专业建设背景下的《桑树栽培及育种学》课程教学改革探索

以新农科建设和蚕学一流专业建设为契机,探索专业核心课程《桑树栽培及育种学》的教学改革。依据《关于一流本科课程建设的实施意见》要求,通过创新教学手段、拓展教学内容、改变教学方式,深入挖掘课程中的思政元素,并借助超星平台建设线上线下教学模式,激发学生的求知欲,增强教学互动,促进学生多元化发展,使学生成长为复合型人才。     

桑树肌动蛋白MaACT3启动子的克隆及农杆菌介导的瞬时表达

【目的】克隆桑树肌动蛋白MaACT3的启动子。【方法】采用抑制PCR技术获得肌动蛋白的5′端侧翼序列;采用农杆菌感染成熟叶片瞬时表达检测启动子活性。【结果】获得的5′端侧翼序列含有基因的翻译起始位点、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分,外显子部分与已报道的桑树肌动蛋白MaACT3序列完全相同。通过荧光显微镜观察到了绿色荧光,在mRNA水平上也检测到表达,证实了获得的5′端序列具有启动活性。【结论】获得的桑树肌动蛋白MaACT3的启动子具有启动活性,可以应用于桑树转基因研究。     

桑树硝酸还原酶基因MaNR的克隆及其表达分析

【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）基因全长cDNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还原酶在桑树生长发育中的作用机制奠定基础。【方法】基于单倍体川桑（Morus notabilis Schneid）基因组数据（http://morus.swu.edu.cn/morusdb）注释的scaffold570序列设计特异引物,硝酸钾处理桑树叶片48 h后使用RNAiso Plus（TaKaRa）和改良CTAB法提取总RNA及基因组DNA,分别以cDNA和DNA为模板,用RT-PCR法克隆获得桑树NR全长cDNA和DNA序列,运用生物信息学手段对推定的氨基酸序列进行分析。以桑胚轴为外植体,在无菌条件下,接种在不同氮源、生长调节物质的培养基中,通过桑树胚轴离体再生过程和real-time PCR方法研究硝酸还原酶基因在离体再生过程中的表达差异以及不同氮源、生长调节物质对NR表达的影响。【结果】克隆获得的桑树NR全长CDS序列,长2 730 bp,编码909个氨基酸,推导的蛋白质分子量为102.84 kD,等电点为6.76。基因组序列长5 142 bp,包含5个外显子和4个内含子,具有完整的5个结构域。通过氨基酸序列比对发现,其序列高度保守,与川桑NR序列同源性达95%,与蔷薇科果树NR序列同源性达78%。聚类分析表明,单子叶植物聚为一组,桑树与蔷薇科果树聚为一组。GenBank登录号分别为KF992020.1和KF992021.1。NR在桑根中表达量最高,叶中表达次之,茎中表达最少;谷氨酸显著提高NR在桑叶中的表达量,GA3显著提高NR在桑茎中的表达量。桑胚轴在单一的NH4+-N培养基中,不能被诱导出愈伤组织及丛生芽,在单一的NO3--N培养基中可以诱导出愈伤组织和丛生芽;但丛生芽继代培养在单一NH4+-N的培养基中和单一的NO3--N培养基中都可以生长。real-time PCR结果显示,NR在子叶和胚轴中的表达量高于胚根。桑胚轴在离体诱导愈伤组织和丛生芽分化过程中,NR的表达量逐渐增加,丛生芽形成后NR的表达量降低并趋于稳定。NH4+-N和NO3-N对NR在继代丛生芽中没有显著影响,谷氨酸对NR在继代丛生芽中有抑制作用,随着培养时间延长,丛生芽的NR相对表达量都降低。【结论】获得了桑树NR全长cDNA序列。硝态氮是桑胚轴诱导的必需营养因子,NR的表达受到桑树细胞脱分化和分化影响。