传染性支气管炎病毒NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达

[目的]生产具有生物活性的、可用于临床检测的NP融合蛋白抗原,建立可用于临床检测IB抗体诊断的试剂盒。[方法]利用RT-PCR技术扩增传染性支气管炎病毒M41株的NP基因,将之克隆并重组于原核表达载体pET-28a,经PCR、酶切鉴定及序列分析构建重组表达载体pET-NP,研究NP基因在大肠杆菌中的可溶性表达。[结果]将重组载体pET-NP转化表达菌BL21,获得阳性重组菌pET-NP-BL。阳性重组子经IPTG诱导后,目的基因NP获得了高效表达。表达产物经过SDS-PAGE与Western blot检测表明,NP分子量约为49 kD,且以可溶性蛋白形式存在;表达产物可与特异性传染性支气管炎病毒抗血清发生免疫反应。表达产物可以用作检测IB抗体的抗原。[结论]该融合蛋白可用于生产检测IB的诊断试剂,生物安全性高,生产方便。但尚需建立适当的检测方法,进一步研究其实际诊断价值。同时也可以研制新型IB重组亚单位疫苗,进一步研究其刺激动物机体产生的细胞与体液免疫,深入研究新功能,筛选新的抗原表位,为生产新型IB基因工程疫苗奠定基础。     

IB(M41株)种毒代次和免疫原性的关系

评估不同代次IBV M41株种毒是否可以作为生产用种子。将M41株种毒用SPF胚连传8代,从中选出第3、第5、第7代,测定其EID50。并用此3代M41株鸡胚尿囊液制毒的油乳苗免疫易感鸡,以HI试验检测其抗体水平。3种疫苗免疫鸡均保护9/10以上,对照鸡全发病;对免疫后与免疫前HI抗体水平的比较表明,免疫后抗体平均滴度提高3倍以上。不同代次的M41毒株的免疫原性仍然保持良好,可以正常用来制造疫苗和建立种子批。     

IBV抗体的银加强金标免疫技术检测

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的银加强金标免疫技术（SECGA）;【方法】将胶体金标记纯化的兔抗鸡IgG,然后将IBV纯化抗原包被于NCM上（0.4ug/片）,封闭后在膜片上滴加不同稀释度（10×2X）的血清,作用10分钟,洗涤后浸于1：4金标兔抗鸡IgG液中作用60分钟,再银染10分钟观察结果;【结果】SECGA能检出IB阳性血清的抗体＞10×27,而不与ND、EDS76、IBD阳性血清发生有意义的交叉反应（抗体滴度＜10×22）。对鸡IgG的最小检测量为0.88ng。用SECGA、气管环中和试验、ELISA试验检测IB抗体有明显的相关性;【结论】银加强金标免疫技术（SECGA）可用于IB抗体的检测,具有敏感、特异、简单、快速、适于现场诊断等优点,适宜于广大基层单位使用。     

应用RT-PCR对新城疫病毒分离株毒力的快速鉴定

根据新城疫病毒 (NDV)强、弱毒株在 F蛋白裂解位点氨基酸组成和序列上的差异 ,参照有关文献 ,设计了 3对引物 (A B,A C,A D)。引物 A B能从 L a Sota、B1 、 系和强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 36 2 bp的核酸片段 ,引物 A C仅能从强毒 F4 8E8的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp的片段 ,引物 A D仅能从 L a Sota、B1 、 系的含毒尿囊液中扩增出 2 5 4 bp片段。 3对引物均不能从 IB、IBD、AI的含毒尿囊液和正常鸡胚尿囊液中扩增出特异片段。从发病鸡群中分离的 3株 NDV毒株均被 A C引物扩出 ,它们的鸡胚平均死亡时间 (MDT)分别为 5 1.8、5 3.2、5 2 .6 h,1日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)为 1.6 5、1.6 3、1.6 0 ,证明是 NDV强毒。利用 RT- PCR对 NDV人工感染鸡最早可于攻毒后第 2天从病鸡气管中检测到 NDV,其次为泄殖腔和脾、肾。利用 RT- PCR对 NDV毒力的鉴定结果与传统生物学试验的测定结果完全吻合 ,但前者可在 2 4 h内直接对组织匀浆进行诊断 ,具有快速、简便和敏感的特点     

鸡减蛋综合征的人工感染试验

用鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）郑州分离株（Ｚ１６）人工感染不同日龄ＨＩ抗体阴性的褐壳蛋鸡，除１０日龄雏组外均表现良好的抗体反应。攻毒后二周，１０，４０，７０，１２０，２００，３６０日龄各组鸡的ＨＩ抗体依次为２．７、６．３、９．７、９．８、８．９、９．０（ｌｏｇ２），２００，３６０日龄组鸡感染后出现典型的ＥＤＳ－７６症状，产蛋率分别下降４５％和１５％，但３６０日龄组异常蛋数量较少，恢复也快些。１２０     

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制

利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体（McAbs）进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。     

鸡新城疫血凝抑制抗体的研究 对不同血凝抑制滴度鸡的攻毒试验

不同免疫水平的鸡攻毒后的保护率与攻毒前血凝抑制(HI)滴度成正相关。HI价在4(Log_2)者保护率为34～64％,在5(Log_2)和5(Log_2)以上者保护率达90～100％,在3(Log_2)和3(Log_2)以下者未免疫鸡保护率仅9％,而免疫过的鸡为43％。全血平板法阳性者攻毒保护率为95％,可疑者42～57％,阴性者20～48％。根据以上结果以HI价4(Log_2)为免疫临界线,群体水平低于4(Log_2)时为易感鸡群,应及时免疫以确保鸡群安全。攻毒后耐过鸡HI抗体递增均值与攻毒前HI水平成负相关,在5(Log_2)以上时,攻毒后HI抗体均值上升甚微或稍有下降。     

产蛋下降综合症(EDS—76)灭活油乳苗免疫试验

鸡产蛋下降综合症(EDS—76)自1976年报道之后,已在全世界许多国家流行发生造成很大经济损失,已被欧洲列为四大病毒性传染病之一。近几年来,在我国北京、上海、江苏等省市首先发生,并很快传入我省。1991年该病在我省局部地区爆发,1992年春季向全省十二个地市漫延,许多鸡场相续爆发,病的流行呈上升趋势。为迅速控制     

鸡新城疫血凝抑制抗体的研究——雏鸡的母源抗体

<正> 母源抗体影响免疫效果的报道很多,目前大多数地区和鸡场已推迟了疫苗接种的日龄,但由于种鸡群的免疫状态不同,母源抗体水平差异很大,影响免疫效果的一致性。尤以污染野毒的鸡群,母源抗体水平很高,如果不考虑鸡群的具体情况,规定统一的雏鸡免疫程序,则其中有相当数量的鸡群未能达到预期的免疫效果。本文试测母源抗体与卵黄抗体和种鸡血清抗体的关系,研究母源抗体动     

鸡减蛋综合征的人工感染试验

用鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）郑州分离株（Ｚ１６）人工感染不同日龄ＨＩ抗体阴性的褐壳蛋鸡，除１０日龄雏组外均表现良好的抗体反应。攻毒后二周，１０，４０，７０，１２０，２００，３６０日龄各组鸡的ＨＩ抗体依次为２．７、６．３、９．７、９．８、８．９、９．０（ｌｏｇ２），２００，３６０日龄组鸡感染后出现典型的ＥＤＳ－７６症状，产蛋率分别下降４５％和１５％，但３６０日龄组异常蛋数量较少，恢复也快些。１２０日龄组无明显症状，但开产期推迟，亦有软、破蛋现象、用２００日龄组（罗曼品种）感染后２０～５０天内下的蛋作喂饲试验；均可使３／４阴性鸡出现７～９（ｌｏｇ２）抗体反应。３００日龄来航鸡感染后不见产蛋下降和蛋壳异常．但可检出８（ｌｏｇ℃２）左右的阳性抗体。用其感染后５～１５天内下的蛋饲喂阴性鸡，仅能使１／４鸡出现短暂的低抗体反应，表明对ＥＤＳ－７６病毒敏感性存在着品种差异。