羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。     

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。