温度胁迫对甘蓝蛋白质磷酸化的影响

用SDS-PAGE放射自显影技术以及液闪测定技术研究了2种温度胁迫条件下甘蓝体外蛋白激酶活性变化及其对Ca^2 的依赖情况,并进行了温度胁迫磷酸化蛋白的分离。结果表明：甘蓝受到高温(35℃)或低温(5℃)胁迫时,体内蛋白激酶活性在3min内迅速升高,随着温度胁迫时间的进一步延长而迅速降低,发现温度胁迫下,蛋白激酶对Ca^2 具有明显的依赖性。从放射自显影结果来看,2种温度胁迫都会发生分子量为22．9kD的特异蛋白质体外磷酸化;在逆境温度处理10min内,磷酸化蛋白质含量较高,随着低温处理时间的延长,磷酸化蛋白质含量迅速下降。     

甘蓝根肿病接种方法的研究

分别比较了菌土接种、蘸根接种对发病的影响,结果显示菌土接种的发病最严重;在接种浓度试验中,浓度越高,发病越重;对不同的根肿菌进行接种比较发现重庆涪陵地区的根肿菌比成都地区根肿菌致病性强,以涪陵地区的根肿菌作为菌源,验证了2个抗病材料99033,99037和2个感病材料99076,99046。并根据实践建立了一套新的田间单株病情分级标准。     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

以含耐热β-淀粉酶的大豆品种中黄20为材料,从未成熟大豆子叶组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出预计大小的cDNA片段.将该片段克隆至pGEM-T载体,经酶切分析和测序,克隆的β-淀粉酶的基因的cDNA片段长1 491 bp,与已报道序列只存在个别的碱基差异,同源性达到99%,编码497个氨基酸残基的多肽,预计相对分子质量56 KD.酶切片段与经相同酶酶切的表达载体pET-43.1(a)连接,转入大肠杆菌中,并使其高效表达.SDS-PAGE表明,大肠杆菌表达的大豆β-淀粉酶的相对分子质量约为50 KD.     

不同小球藻对工业废水中金属离子吸附能力比较

研究了5种小球藻(Chlorella phyrenoidosa,Chlorella vulgaris,Chlorella ellipsoidea,Chlorella sorokiniana,Chlorella sp.)对电镀厂污水中部分金属离子的吸附情况。结果表明：各种小球藻对测定的Zn^2 ,Cu^2 ,Ni^2 ,Cr^3 等金属离子都有一定吸附能力,不同小球藻对同一离子的吸附能力存在差异,同一小球藻对不同离子的吸附能力有不同。综合看来,Chlorella phyrenoidosa和Chlorella vulgaris对上述离子都有较好的吸收。     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立

M–位点受体激酶（MLPK）是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列（记为MLPKK）,通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体（记为mlpk1和mlpk2）,然后以pET43.1a为载体构建了原核表达质粒pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6× His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在pET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。     

结球甘蓝花粉钙调素基因的克隆与表达分析

 根据芸薹属植物钙调素基因保守区域设计引物,采用同源克隆的方法从结球甘蓝自交不亲和系和自交系花粉中克隆得到一个钙调素开放阅读框cDNA 序列,该序列长450 bp,编码149 个氨基酸;编码蛋白不含跨膜区,无信号肽,具有4 个完整的EF-hand 结构域。构建了结球甘蓝花粉钙调素原核表达系统,钙调素基因及其3 个突变体在E. coli 中得到表达,均获得分子量约为16 kD 的可溶性融合蛋白,在EGTA 存在的条件下,各融合蛋白具有各自独特的凝胶迁移现象,活性检测表明甘蓝花粉钙调素活性依赖于钙离子。该基因在甘蓝自交不亲和系花粉萌发过程中表达量先上升后下降,在自交系中随花粉萌发增大而降低;在含有钙调素拮抗剂TFP 的培养基中,自交不亲和系和自交系花粉中钙调素基因表达量均受到抑制;在含有W-7 琼脂糖的培养基中无明显差异。     

芸薹属A基因组DNA封阻下的C染色体组核型分析

为了探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法,本文以甘蓝和白菜为实验材料,分别提取甘蓝基因组DNA用地高辛标记为探针,提取白菜基因组DNA作为封阻剂,对甘蓝有丝分裂中期染色体进行原位杂交,每对同源染色体上显示出了特定的原位杂交信号,将甘蓝的9对染色体进行了精细的分型。为区分像甘蓝这样的小型染色体提高了一条可行且精确的方法,并为研究甘蓝自交不亲和性信号传导相关基因在染色体上的定位奠定重要基础。     

MAR调控的胰岛素样生长因子-Ⅰ转化甘蓝的研究

 采用根癌农杆菌介导法, 将表达框两翼构建了核基质结合区(matrix attachment region, MAR)的胰岛素样生长因子-Ⅰ ( Insulin-like Growth Factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ) 基因导入甘蓝中, 在含卡那霉素的培养基上连续4次筛选, 通过10个批次的转化试验, 获得25株抗性植株, PCR检测均呈阳性, 随机选取5株进行基因组Southern杂交, 结果有3株出现了杂交带, 表明IGF-Ⅰ基因已成功整合到甘蓝基因组中。