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采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础. 相似文献
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蛋白质相互作用技术在热带植物病毒研究中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction)承载着生物体生命活动的各个过程,研究热带植物病毒中的蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示病毒蛋白质的功能,还可以揭示病毒在寄主细胞中的侵染机理,从而制定相关策略预防病毒的突然爆发或进行疾病治疗。而蛋白质相互作用研究方法已有50多年的历史,如早期的化学交联法;并且该方法的技术在不断地完善和更新,产生了一序列新的技术,包括酵母双杂交、GST pull-down,免疫共沉淀和串联亲和纯化等多种技术。由于本实验室在热带植物病毒研究中涉及了多种蛋白质相互作用技术,为此,本文总结热带植物病毒研究中常用的蛋白质相互作用技术。 相似文献
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辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备 总被引:4,自引:1,他引:3
采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物(ChiVMV-WC)的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b(+)上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。 相似文献
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海南香蕉条斑病毒的检测 总被引:1,自引:0,他引:1
香蕉条斑病毒(Banana streak virus,BSV)是香蕉上一种重要的病毒。本文运用血清学检测法和PCR检测法对海南主栽巴西蕉(Musa Cavendish,AAA)、粉蕉(Musa Pisang Awak,ABB)进行了BSV的调查检测。结果表明,参试无症状或症状各异的样品血清学检测结果均为阴性,说明这些被测品中可能不含有游离BSV粒子;上述样品中部分样品的PCR检测结果却为阳性,将PCR扩增的特异条带回收、测序和比对,显示确实扩增到BSV部分基因组序列。结合血清学检测结果,说明海南部分香蕉的基因组已经整合了BSV的基因组序列。 相似文献
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为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定(ID-ELISA),效价高达1 ∶ 125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1 ∶ 5 000~1 ∶ 25 000之间。 相似文献
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有害生物综合治理的系统学特征分析 总被引:2,自引:0,他引:2
对有害生物综合治理进行系统学特征分析,指出有害生物综合治理具有整体性、层次性、开放性和演化性等系统特征,提出用系统科学原理和方法建立新的有害生物综合治理体系的基本思路。 相似文献
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香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuestTM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。 相似文献
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菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500~1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。 相似文献