CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

发展海水深水网箱养殖的几个问题

海水鱼类的工厂化养殖和小网箱养殖是我国海水养殖第四次浪潮的主要内容,已经取得了显著的经济效益和社会效益。但由于工厂化养殖和小网箱养殖密度高,水体交换差,发生病害几率多,一定程度上影响和降低了养殖鱼类的品质。发展抗风浪、适宜深水海区的大型网箱养殖,是当前和今后世界海水养鱼的方向和潮流。一、深水网箱的发展现状1.国外深水网箱养殖发展情况。国外开展深水网箱养殖海水鱼类的国家主要有挪威、希腊、英国、美国、加拿大、澳大利亚、日本、韩国等,发展历史最早的是日本,发展最快最现代化的是挪威。国外深水网箱养殖发展基本具有…     

气调贮藏对水果、蔬菜生理生化的影响(连载之三)

六、对挥发性物质的影响 A.长期CA贮藏后果实风味的损失一般而言,CA贮藏使得大部分产品品质更佳,但长期地置于一定的CA条件下会失去风味。虽然乙醇和乙醛作为许多果实典型风味中复杂挥发性物质的一部分,但这些物质在组织中过多积累可能引起风味异常或生理伤害,以致品质低劣,这些情况常发生在长期贮藏后或产品处于缺氧的环境中。各种研究已经证明,不同的贮藏条件影响果实挥发物质的生成,在一定的CA条件下长期贮藏,果实可能     

气调贮藏对水果蔬菜生理生化的影响(连载之二)

四,对有机酸碳水化合物及其代谢物质的影响 A.对有机酸代谢的影响 1.减少有机酸的损失据Rollas等报道,气调贮藏的苹果和梨同空气中贮藏的果实相比能保持较高的有机酸含量。许多其它报道也指出,通过气调能够显著地抑制冷藏期间可滴定酸的减少。气调贮藏的苹果和梨果实中的酸度降低主要是由于     

水果采后的商品化处理综述

一、国内目前水果生产现状及商品化处理的必要 性 食物结构和营养膳食水平是一个国家经济发达程度和人民生活水平高低的重要标志之一。近20年来，我国人民的饮食已从半温饱型转变为温饱型，并正向小康型迈进。新鲜水果和蔬菜已成为人们科学合理的膳食结构中重要的组成部分。据国家统计局数字，从1993年开始，我国水果总产量已超过印度、巴西和美国，跃居世界第一位。1999年全国水果总产量达到6237.6万吨，比1978年的657万吨增加了9.49倍，占世界水果总产量4.45亿吨的14％。但目前存在的主要问题之一是果园总体管理水平较低，优质果率不到水…     

能观察池鱼吃食的活动食台

广大养鱼户都知道，饲养鱼类在投喂精料时，都应设置沉性食台，将饲料定时投在食台上供鱼摄食。那么，如何确定每天的投喂量呢?如果能将这种沉性食台改制成活动式食台，即可以观察确定了。     

肉鸡场建设与饲养设备要求

（一）选址 场址应选在地势高燥、背风向阳的地方,鸡舍南向或南偏东向,以利夏季通风或冬季保温。场址选在村外,距公路干线及其他养殖场较远,低洼地、污水河边不要建场。     

朝阳地区烤烟施肥情况调研报告

WANG Chun-sheng(Chaoyang company of Liaoning Tobacco Company,Chaoyang,Liaoning 122000)     

多变时滞Volterra型动力系统的稳定性

探讨了一类多变时滞积分微分动力系统,并通过不动点方法给出了该系统零解渐近稳定的充要条件.在构造算子时,根据动力系统时滞特点,分别引入对应的连续函数h_i(s),i=1,2,…,n,然后利用这n个函数来构造算子,最后再利用Banach不动点方法来研究该动力系统的稳定性.