小瓜虫疫苗研究进展及突破方向——访美小瓜虫研究机构思考

小瓜虫病是世界范围内严重危害淡水养殖鱼类的主要寄生虫病。美国农业部水生动物健康研究所、佐治亚大学兽医学院和康奈尔大学兽医学院3家研究机构在鱼类小瓜虫病及疫苗研究方面走在世界前列。为提升我国鱼类寄生虫研究水平,我们访问了此3家小瓜虫病研究机构,并与美国小瓜虫研究学者进行了交流。在总结了访美收获的基础上,介绍了小瓜虫的研究进展,并就我国小瓜虫疫苗研究需要的科研设施建设、突破的主攻方向及国内外合作提出了建议。     

桂花鱼暴发性流行病病因剖析

1994年以来，广东省桂花鱼(学名鳜鱼)养殖主产区暴发了大规模的流行病，造成严重的经济损失。为控制此病提供依据，我们开展了病因探讨，经跟踪调查与试验分析，归纳出与病因相关的因素或特性。     

嗜水气单胞菌毒力因子检测及不同毒力 基因型菌株对剑尾鱼的致病性研究

选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的4种主要胞外毒力因子(气溶素、溶血素、胞外蛋白酶和细胞毒性肠毒)设计合成4对引物,对2008—2009年广东、江西两省的临床分离菌株进行检测,评价菌株毒力基因的分布特征及其毒力强弱。60株临床分离株中,具有4种毒力基因(aer+hly A+epa+act+)的菌株占58.33%(35/60),是主要毒力基因型;其他25株的毒力基因有不同数量缺失。不同基因型的代表菌株对剑尾鱼攻击试验结果表明,嗜水气单胞菌毒力因子之间表现出协同作用,aer+hly A+epa+act+型的毒力最强,对剑尾鱼的致死率最高。     

哈氏弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗的效果研究

采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS).通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联.OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳鲹(Trachinotus cvatus).检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳鲹经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单混合物免疫后,各免疫组间血清溶菌酶活性没有显著差异(P＞0.05),但均显著高于生理盐水对照组(P＜0.05);OMPC-LPS偶联物免疫组的血清抗溶藻弧菌EpGS021001抗体效价较单纯溶藻弧菌LPS免疫组、简单混合物免疫组出现得早,抗体滴度高;与此类似,OMPC-LPS偶联组中抗哈氏弧菌SpGY020601的血清抗体效价较单纯哈氏弧菌OMPC组、简单混合组出现得早,抗体滴度高,且持续时间长;对EpGS021001、SpGY020601的攻击,OMPC-LPS偶联物免疫组的保护率分别为85%和95%,高于单纯溶藻弧菌LPS免疫组的70%、单纯哈氏弧菌OMPC免疫组的75%,也高于简单混合物免疫组的80%和82.5%.     

嗜水气单胞菌GYK1株培养基的优化

在营养肉汤培养基的基础上,经过一系列嗜水气单胞菌GYK1株培养试验,结果证明,成本价格较低的蔗糖、酵母膏可以代替葡萄糖、牛肉膏,从而降低培养基原料成本;添加少量的K2HPO4和微量元素溶液(Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+)可明显提高培养液的活菌数;通过正交试验得到低成本、高得率的适合嗜水气单胞菌GYK1菌株生长的培养基配方,该培养基组成(g/L):蛋白胨10.0、酵母膏10.0、蔗糖15.0、K2HPO42.28;NaCl 5.0微量元素(硫酸镁0.1,硫酸亚铁0.04,硫酸锌0.00375,二氯化锰0.0021)。24 h摇瓶培养,菌液中的最高活菌数可达316×108cfu/mL,比营养肉汤培养基活菌数(151×108cfu/mL)提高100%以上。     

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用１８株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致,另外,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射,与原代比较,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致,感染后死亡时间相对集中。水生实验动物剑尾鱼在检测鱼类细菌的毒力方面有较好的应用前景。     

19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-Tvector载体筛选阳性重组子进行序列测定.结果显示,OmpK基因分别含有786bp～849 bp的开放读码框,编码261～282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%～100%,推测氨基酸序列的相似性为71%～100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高.序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌.本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性.由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础.     

酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中的应用研究

研究了酸性α-醋酸萘酯酶染色法在鳜细胞免疫水平检测中应用的可行性。用不同比重的淋巴细胞分离液对鳜外周血中的淋巴细胞进行分离,结果表明比重为1.080的分离液可最大程度地将鳜外周血中的淋巴细胞分离出来。用酸性α-醋酸萘酯酶染色法对分离出的淋巴细胞进行染色,结果显示最佳的染色条件为在pH6.0~6.5的孵育液中37℃孵育90 m in,然后2%甲基绿37℃复染10 m in,酸性α-醋酸萘酯酶阳性细胞胞核被染成绿色而胞浆被染成红色,阴性细胞胞核和胞浆都被绿染。对正常未免疫鳜与嗜水气单胞菌脂多糖和鳜病毒主要衣壳蛋白免疫一周后的鳜外周血淋巴细胞染色计数,结果酸性α-醋酸萘酯酶阳性细胞所占的比例分别为15%~18%、33%~40%和26%~29%,方差分析表明免疫组与对照组阳性率差异极显著,说明α-醋酸萘酯酶染色法可用于鳜细胞免疫水平的检测。     

养殖乌鳢结节病的病原分析

[目的]分析了解乌鳢结节病的病原。[方法]以患病乌鳢为研究材料,通过组织病理学观察和人工感染试验,确定乌鳢结节病的病原性质 通过基本生理生化特性、16 S rRNA基因部分序列和药物敏感性的测定,对乌鳢结节病的病原进行鉴定。[结果]组织病理学观察显示典型结节的中央为干酪样坏死,内含坏死的组织细胞和白细胞,其间有大量呈长杆状或分枝状菌丝 从病鱼的肾脏、肝脏等多个组织及腹水中均分离培养出细菌,用分离菌株作回归感染,证实分离菌株为乌鳢结节病的病原菌 通过对病原菌的基本生理生化特性测定和16 S rRNA基因部分序列分析,初步确定乌鳢结节病的病原为诺卡氏菌属的鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）。[结论]该研究为乌鳢结节病的进一步研究奠定了基础。